白芍不同提取方法及指紋圖譜的研究△

張娟，劉美，肖炯昌，李先寬，蘇永健，馬琳*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.清華德人西安幸福制藥有限公司，陜西 西安 710043)

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，性涼，味苦、辛、酸，微寒，歸肝、脾經(jīng)?？芍雇雌礁巍⑷岣窝a(bǔ)血、收汗斂陰、平抑肝陽等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，白芍在抗氧化活性，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，保護(hù)心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等過程中體現(xiàn)一定的治療作用[1-3]。這些治療作用與白芍中活性成分密切相關(guān)，據(jù)研究，白芍中主要有萜苷類、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸類等化合物，目前對(duì)白芍的質(zhì)量控制主要以芍藥苷為考察指標(biāo)，這種單一成分的檢測(cè)難以全面控制白芍內(nèi)在質(zhì)量，并且隨著中藥生產(chǎn)工業(yè)水平的不斷提高，企業(yè)以追求高效無污染、操作簡(jiǎn)便、成本低、利于儲(chǔ)存的中藥提取方法也日趨顯著，本研究以白芍中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷及沒食子酸的含量為指標(biāo)，比較不同的提取工藝對(duì)3種成分含量的影響，并建立不同產(chǎn)地、不同規(guī)格白芍藥材的指紋圖譜。以期為高效合理地利用白芍藥材資源及中藥規(guī)范化生產(chǎn)、標(biāo)準(zhǔn)化加工、綜合評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量提供一些參考和借鑒，為白芍藥材及其他含白芍的中藥復(fù)方制劑制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)依據(jù)[4-5]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT液相色譜儀，二元泵、SPD-20A紫外-可見光檢測(cè)器、柱溫箱、LCsolution色譜數(shù)據(jù)工作站；KH3200B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFT-200中藥粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；FA2004電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；BT125D分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑

對(duì)照品芍藥苷、沒食子酸(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110736-201741、110809-201205)；對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷(購自天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司，含量大于98%)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；水為重蒸餾水。

白芍藥材經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonialactiflorapall的干燥根，分別產(chǎn)于安徽亳州及浙江杭州。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Thermo hypersil BDS C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脫0.01 min，5%A；0.01～5 min，13%A；5～7 min，15%A，7～18 min，15%A；18～25 min，25%A；25～42 min，50%A，42～45 min，5%A。檢測(cè)波長為230 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；體積流量為1 mL·min-1。

2.2 提取工藝的考察

2.2.1 提取方法 超聲提取：精密稱取白芍樣品根的粉末約0.2 g，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，超聲提取30 min；放冷，加70%乙醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

加熱回流提?。壕芊Q取白芍樣品根的粉末約0.2 g，置50 mL單口圓底燒瓶中，用移液管加70%乙醇25 mL，稱定重量，球形冷凝管加熱回流提取30 min；放冷，稱定重量，加70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。提取方法的考察結(jié)果見表1。

結(jié)果表明，用70%的乙醇超聲提取30 min時(shí)，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸的含量均比用70%的乙醇加熱回流提取30 min含量高。

2.2.2 提取時(shí)間 精密稱取白芍樣品根的粉末4份，每份約0.2 g，置25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解，分別超聲提取(頻率為45 Hz，功率為240 W)15、30、45、60 min，放冷，加70%乙醇定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。提取時(shí)間的考察結(jié)果見表2。

表2 提取時(shí)間考察結(jié)果

結(jié)果表明，超聲時(shí)間為30 min時(shí)，芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸的含量最高，因此制備供試品溶液的最佳提取時(shí)間為30 min。

2.2.3 提取溶劑 精密稱取白芍樣品根的粉末6份，每份約0.2 g，置25 mL容量瓶中，分別加50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、無水甲醇、無水乙醇溶解，超聲提取(頻率為45 Hz，功率為240 W)30 min，放冷，加相應(yīng)的提取溶劑定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。提取溶劑的考察結(jié)果見表3。

表3 提取溶劑考察結(jié)果

結(jié)果表明，70%乙醇提取的樣品，芍藥苷的含量最高；50%甲醇提取的樣品芍藥內(nèi)酯苷和沒食子酸的含量最高；但單萜苷的總和(芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷)用70%的乙醇提取的含量最高。

通過上表數(shù)據(jù)可得，當(dāng)測(cè)定白芍中芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸的含量時(shí)，供試品溶液的制備方法應(yīng)為取白芍樣品根的粉末，精密稱定，加50%甲醇定容，超聲處理30 min，取出，放至室溫，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，即得。測(cè)定白芍中芍藥苷的含量時(shí)供試品溶液的制備方法應(yīng)為取白芍樣品根的粉末，精密稱定，加70%乙醇定容，超聲處理30 min，取出，放至室溫，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，離心，即得。

2.3 沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷成分的含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸對(duì)照品適量，置于10 mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品溶液，3個(gè)對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度分別為75、75、53 μg·mL-1。

2.3.2 供試品溶液的制備 同2.1項(xiàng)下所述。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸對(duì)照品精密稱定，以甲醇溶解并稀釋至5 mL容量瓶中，搖勻，分別配置成質(zhì)量濃度分別為0.400、0.120、0.076 g·L-1的對(duì)照品溶液，作為母液，依次對(duì)倍稀釋7個(gè)濃度，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得3種成分的回歸方程，結(jié)果表明，各化合物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見表4。

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.4 精密度試驗(yàn) 精密稱取芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸2.00、0.60、0.38 mg，定容到5 mL容量瓶中，制備對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。測(cè)定峰面積，計(jì)算芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸峰面積的RSD分別為1.12%、1.45%、1.85%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取白芍樣品(AH05)6份，制備供試品溶液，計(jì)算芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸峰面積的RSD分別為1.55%、2.69%、2.41%。結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取白芍樣品(AH05)1份，制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、24 h注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸峰面積的RSD分別為2.50%、1.47%、1.58%，結(jié)果顯示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率 精密稱取白芍樣品(AH05)6份各40 mg，分別加入沒食子酸對(duì)照品約0.03 mg、芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品約0.23 mg、芍藥苷對(duì)照品約1.76 mg，按2.3項(xiàng)制成供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸的回收率和RSD分別為97.83%、2.7%；100.42%、3.0%；101.00%、2.5%。

2.4 白芍高效液相色譜-二級(jí)陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)指紋圖譜共有模式的建立

2.4.1 指紋圖譜的采集 按2.2項(xiàng)下供試品溶液的最終制備方法制樣，依照2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，應(yīng)用藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012版)，建立23批白芍藥材樣品的HPLC-DAD指紋圖譜，結(jié)果見圖1。采用中位數(shù)法進(jìn)行特征峰篩選，AH20作為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正最終得到的共有模式圖，確定了19個(gè)共有峰，結(jié)果見圖2。經(jīng)與對(duì)照品定性，圖中1號(hào)峰為沒食子酸，6號(hào)峰為芍藥內(nèi)酯苷，8號(hào)峰為芍藥苷，對(duì)照品色譜圖見圖3。

2.4.2 樣本指紋圖譜相似度分析 將23批藥材樣本與計(jì)算得到白芍藥材共有模式相比較，計(jì)算夾角余弦相似度。結(jié)果顯示，有3批樣品相似度低于0.9，其他各批次的相似度均在0.9以上。相似度計(jì)算結(jié)果見圖4。

由上圖可以看出樣本11、樣本12和樣本23相似度低于0.9，3個(gè)樣本相似度低的主要原因是芍藥苷色譜峰面積比值在其指紋圖譜中不占主導(dǎo)地位，故屬離群樣本，而樣本11、12為硫熏白芍，由圖1中AH-11、AH-12的色譜圖可以看出芍藥苷與其他未硫熏白芍樣品相比，色譜峰明顯偏低。本實(shí)驗(yàn)所收集樣品除樣本23為杭白芍，其相似度低于0.9，其他亳白芍樣本相似度均為0.9～1.0，說明同一產(chǎn)地藥材的化學(xué)組成比較接近，不同產(chǎn)地樣本差異性較大。

注：AH01～AH21.亳白芍(編號(hào)1～21)；G1709(編號(hào)22)；HZ01.杭白芍(編號(hào)23)。圖1 白芍藥材色譜疊加圖

注：1.沒食子酸；6.芍藥內(nèi)酯苷；8.芍藥苷。圖2 白芍指紋圖譜共有模式圖

注：A.沒食子酸；B.芍藥內(nèi)酯苷；C.芍藥苷。圖3 白芍藥材對(duì)照品的HPLC圖

圖4 23批樣品HPLC-FP相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

文中采用HPLC分別考察了不同提取方法、不同提取時(shí)間及不同提取溶劑對(duì)白芍中沒食子酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷3種成分提取率的影響，以具體數(shù)值的形式獲得最佳提取工藝，該方法不僅具有實(shí)用性，而且還具有可比性，希望可以為白芍中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷及沒食子酸成分的深入開發(fā)研究提供理論依據(jù)。同時(shí)嚴(yán)格控制中藥材及復(fù)方制劑的生產(chǎn)加工，深入研究過程工藝對(duì)充分發(fā)揮中藥活性成分的作用及中藥材標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)具有十分重要的意義。

查閱白芍近十年有關(guān)含量測(cè)定及指紋圖譜的文獻(xiàn)，大部分研究[6-13]所建立的含量測(cè)定及指紋圖譜的方法主要以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為主。中藥的成分復(fù)雜多樣，同時(shí)中藥的功能具有全方位、多靶點(diǎn)的特征，應(yīng)更全面、更深入地研究中藥中具有藥效作用的活性成分，白芍中芍藥內(nèi)酯苷為芍藥苷的同分異構(gòu)體，在白芍中的含量?jī)H次于芍藥苷，是另一種具有代表性的萜苷類化合物。而沒食子酸在白芍藥材中雖然含量較少但是其抗炎、抗突變、抗自由基等作用不容忽視，具有重要研究?jī)r(jià)值。因此本實(shí)驗(yàn)同時(shí)選取了沒食子酸及芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷3個(gè)活性成分[14]。

根據(jù)不同溶劑的考察結(jié)果可知，沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷的提取量：50%甲醇>70%乙醇>50%乙醇>70%甲醇>無水甲醇>無水乙醇。50%甲醇和70%乙醇的提取率相差不大，考慮到甲醇的毒性較乙醇大，也有文獻(xiàn)報(bào)道樣品在加熱提取過程中，甲酯化比乙酯化更容易發(fā)生，所以適當(dāng)?shù)那闆r下可以考慮用70%乙醇代替50%甲醇提取白芍中的沒食子酸及芍藥內(nèi)酯苷[15]。

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和沒食子酸在200～700 nm波長下掃描，215 nm下沒食子酸的吸光度最高，芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷在230 nm下的吸光度最高，但215 nm受末端吸收影響，干擾峰較多，230 nm處基線平穩(wěn)，色譜峰數(shù)目較多，故檢測(cè)波長確定為230 nm。

該實(shí)驗(yàn)所建立的指紋圖譜同時(shí)對(duì)比分析了硫熏與未硫熏白芍的成分變化，比較了亳白芍和杭白芍色譜峰的差異性，HPLC指紋圖譜相似度分析結(jié)果與白芍不同樣本中芍藥苷的含量高低一致，二者結(jié)合可更科學(xué)、全面地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。且所建立的指紋圖譜測(cè)定方法中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、沒食子酸3個(gè)指標(biāo)成分在18 min之前出峰，出峰時(shí)間較短，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，在企業(yè)大批量檢測(cè)樣品時(shí)不僅重復(fù)性好，而且省時(shí)，可為制定實(shí)用性的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)提供參考。