HPLC同時(shí)測(cè)定生地黃湯顆粒中11種指標(biāo)性成分的含量△

劉基，李佳，程江雪，2，鄒俊波，2，郭東艷，2*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712046)

生地黃湯為唐代孫思邈《千金方》中收載方，由生地黃、大黃組成，具有滋陰涼血、化瘀止血的功能，主要用于腎陰虧虛、瘀血阻滯引起的吐、衄血百治不愈及崩漏。生地黃湯顆粒為生地黃湯經(jīng)提取濃縮后制成的顆粒劑。方中生地黃為主藥，味甘，寒，入心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津之功能。《藥性論》曰其“通血脈，破血，通利月水閉絕……搗敷心腹，能消瘀血?！薄堕_寶本草》云生地黃“破惡血……通血脈，主婦人崩中血不止及產(chǎn)后血上薄心悶絕，傷身胎動(dòng)下血，瘀血，留血，衄血，吐血?！薄侗静萁?jīng)疏》稱地黃為“補(bǔ)腎家之要藥，益陰血之上品”，是中藥復(fù)方用藥頻率較高的藥味之一[1]。生地黃主要含有苷類、糖類及氨基酸類等成分，其中環(huán)烯醚萜苷類成分和苯乙醇苷類成分是地黃中的主要成分，同時(shí)也是地黃發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前已分離出的環(huán)烯醚萜苷類化合物中，梓醇含量最高，此外尚含有桃葉珊瑚苷、地黃苷A、地黃苷D等[2-6]。苯乙醇苷類成分主要以毛蕊花糖苷為主[7]。大黃主要含有蒽醌、鞣質(zhì)等成分[8]，其中蒽醌苷元是大黃活血化瘀主要物質(zhì)基礎(chǔ)[9]。目前關(guān)于生地黃、大黃單味藥的含量測(cè)定方法較多[10-13]，但是有關(guān)生地黃湯或生地黃大黃配伍的中藥復(fù)方中相關(guān)指標(biāo)性成分的含量測(cè)定未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用HPLC法對(duì)生地黃湯顆粒中的主要成分進(jìn)行含量測(cè)定方法學(xué)考察，以期建立同時(shí)測(cè)定11種主要指標(biāo)性成分含量的方法，為生地黃湯顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供依據(jù)，同時(shí)也為中藥復(fù)方中含有生地黃大黃藥對(duì)的制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(G1311C型四元泵、G1329B型進(jìn)樣器、G4212B型二極管陣列檢測(cè)器、Open LAB工作站)；電子天平[萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；SartoriusMC 電子天平(十萬(wàn)分之一)。

1.2 試藥

生地黃飲片購(gòu)買于寶雞漢方國(guó)藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)高級(jí)實(shí)驗(yàn)師王繼濤鑒定為玄參科(Scrophulariaceae)植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的塊根；大黃飲片購(gòu)于蘭州旭康藥業(yè)有限公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)高級(jí)實(shí)驗(yàn)師王繼濤鑒定為廖科(Polygonaceae)植物掌葉大黃RheumpalmatumL.的干燥根及根莖；生地黃湯顆粒實(shí)驗(yàn)室自制(批號(hào)分別為20171001、20171201、20180301)。

梓醇(批號(hào)：110808-200508)、沒食子酸(批號(hào)：110831-200302)、蘆薈大黃素(批號(hào)：110795-200806)、大黃酸(批號(hào)：110757-200716)、大黃素(批號(hào)：110756-201010)、大黃酚(批號(hào)：110796-200310)、大黃素甲醚(批號(hào)：110758-200611)對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；桃葉珊瑚苷(批號(hào)：1512102)、地黃苷A(批號(hào)：16051725)、地黃苷D(批號(hào)：150401)、毛蕊花糖苷(批號(hào)：150402)對(duì)照品，購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；水為娃哈哈純凈水；乙腈為fisher色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Accurasil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(C)-0.1%磷酸水(D)梯度洗脫(洗脫程序見表1)，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)以梓醇計(jì)不低于3000。對(duì)照品及供試品的色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序

注：A.混合對(duì)照品；B.供試品；1.梓醇；2.沒食子酸；3.桃葉珊瑚苷；4.地黃苷D；5.地黃苷A；6.毛蕊花糖苷；7.蘆薈大黃素；8.大黃酸；9.大黃素；10.大黃酚；11.大黃素甲醚。圖1 對(duì)照品及樣品HPLC圖

2.2 溶液及樣品的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，色譜甲醇溶解，分別制成質(zhì)量濃度分別為110、55、198、132、220、176、99、99、98、98、99 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密移取梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚各0.1 mL至量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為10.0、5.0、18、12.0、20.0、16.0、9.0、9.0、8.9、8.9、9.0 μg·mL-1大黃素甲醚的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 生地黃湯顆粒 按照處方比例稱取生地黃600 g，大黃20 g，加10倍量20%乙醇浸漬提取36 h，濾過，濾液減壓濃縮、干燥(60 ℃)，粉碎，80%乙醇制粒，即得生地黃湯顆粒劑[14]，批號(hào)分別為：20171001、20171201、20180301。

2.2.4 供試品溶液 稱取生地黃湯顆粒約2.0 g，研細(xì)，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入色譜甲醇20 mL，精密稱重，超聲30 min，放至室溫，用色譜甲醇補(bǔ)足重量，搖勻并濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 用移液器分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.063、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mL，置于2 mL量瓶中，色譜甲醇稀釋至刻度，搖勻，得6個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液。在2.1色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，以各成分的質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)分別對(duì)相應(yīng)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)(見表2)，結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各成分均有良好的線性關(guān)系。

表2 11種成分的線性回歸方程及線性范圍 μg·mL-1

2.3.2 精密度試驗(yàn) 分別精密移取2.2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，按照2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積積分值的RSD分別為1.37%、0.98%、1.16%、1.21%、1.05%、0.99%、1.16%、1.15%、1.02%、1.00%、1.03%，均符合要求，表明該儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.4項(xiàng)下供試溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰峰面積積分值的RSD分別為1.64%、1.24%、1.31%、1.00%、1.05%、0.98%、1.20%、1.09%、0.98%、1.06%、1.12%，均符合要求，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下生地黃湯顆粒6份(批號(hào)：20171001)，分別按照2.2.4項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，依照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算各成分含量及RSD。結(jié)果生地黃湯中梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為4.346 3、1.742 0×10-2、0.102 1、1.487 2、0.585 5、0.423 1、0.342 6×10-2、1.113 8×10-2、0.414 8×10-2、0.241 5×10-2、0.050 8×10-2mg·g-1；含量的RSD分別為1.69%、1.34%、2.15%、1.00%、1.21%、1.56%、2.27%、1.74%、1.35%、1.65%、1.16%，表明重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批生地黃湯顆粒6份(批號(hào)：20171001)，分別加入適量梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚對(duì)照品。按照2.2.4項(xiàng)下方法制備供試液，依照2.1項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量及加樣回收率。結(jié)果梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為98.73%、97.09%、96.43%、97.36%、97.87%、96.34%、96.67%、96.17%、97.04%、97.97%、97.11%；RSD分別為0.97%、1.35%、0.72%、1.47%、0.98%、0.64%、1.29%、1.78%、1.41%、0.77%、1.04%。說明該方法準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

續(xù)表3

2.3.6 樣品含量測(cè)定 取3批生地黃湯顆粒，按2.2.4項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算樣品中梓醇、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，結(jié)果見表4。

3 討論

《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版(一部)中地黃項(xiàng)下僅對(duì)梓醇和毛蕊花糖苷進(jìn)行測(cè)定[15]，而且采用了兩種測(cè)定方法，較為繁瑣。地黃中主要含有環(huán)烯醚萜苷及苯乙醇苷，而且這兩大類成分也是其主要活性成分，中華人民共和國(guó)藥典中僅對(duì)梓醇及毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測(cè)定，難以全面反映該飲片的質(zhì)量。因此對(duì)主要活性成分進(jìn)行含量測(cè)定方法學(xué)考察，確定含量測(cè)定方法，對(duì)于全面有效控制制劑的質(zhì)量具有重要的意義。

波長(zhǎng)的選擇：在進(jìn)行含量測(cè)定方法學(xué)考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)梓醇、桃葉珊瑚苷、地黃苷A、地黃苷D在203 nm處有末端吸收，毛蕊花糖苷最大吸收在334 nm處，大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在252 nm處有強(qiáng)吸收峰[16-18]。經(jīng)過在不同波長(zhǎng)下及轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梓醇在252 nm及334 nm響應(yīng)值均較小，毛蕊花糖苷及大黃各成分在210 nm處有較高響應(yīng)值。而采用轉(zhuǎn)化波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定時(shí)基線波動(dòng)較大。綜合考慮各成分在210 nm波長(zhǎng)下，均能得到較好的響應(yīng)值，靈敏度較好，雜質(zhì)峰干擾較小，同時(shí)也避免了更換檢測(cè)波長(zhǎng)引起的基線漂移，最終確定210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表4 生地黃湯顆粒中11種成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)mg·g-1

流動(dòng)相的確定：依據(jù)待測(cè)11種成分的理化性質(zhì)及色譜行為，實(shí)驗(yàn)過程對(duì)不同比例的甲醇-0.1%磷酸溶液及乙腈-0.1%磷酸溶液進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，以甲醇-0.1%磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫，系統(tǒng)壓力較高，以乙腈-0.1%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30 ℃，流速1 mL·min-1時(shí)，樣品中各成分分離度良好，峰形尖銳對(duì)稱，色譜圖基線平穩(wěn)，因此最終確定以乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。

本實(shí)驗(yàn)建立了生地黃湯顆粒中11種指標(biāo)成分梓醇、沒食子酸、桃葉珊瑚苷、地黃苷D、地黃苷A、毛蕊花糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量測(cè)定方法，方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均符合要求。而且操作簡(jiǎn)單、對(duì)儀器設(shè)備要求不高，重復(fù)性好，能夠同時(shí)進(jìn)行11種成分的含量測(cè)定，簡(jiǎn)化了樣品制備方法，節(jié)約分析時(shí)間，可用于生地黃湯顆粒的質(zhì)量控制，同時(shí)也為其他含地黃大黃藥對(duì)的中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制提供了參考。