蒙藥蒙根竅吉散質量標準中含量測定方法的建立△

李柱，呂穎，張海濤，王杰，張春紅*，李旻輝，4*

(1.內蒙古額濟納旗蒙醫(yī)醫(yī)院，內蒙古 額濟納旗 735400；2.赤峰市藥品檢驗所，內蒙古 赤峰 024000；3.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014060；4.內蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所，內蒙古 呼和浩特 010110)

蒙藥蒙根竅吉散為內蒙古西部常用蒙藥制劑，由鎖陽、沙棗果、駱駝奶酪、冰糖等配方組成，有強壯、鎮(zhèn)靜、固精、止瀉、調經(jīng)等功能，臨床上主要用于治療胃痛、腹瀉、身體虛弱、肺熱咳嗽等疾病，其效果顯著。由于目前評價蒙根竅吉散質量的檢測方法水平較低，指標較少，尚無薄層鑒別、含量測定等控制指標，無法滿足當前國家、自治區(qū)對蒙醫(yī)藥制劑的質量評價要求，無法更好地指導臨床用藥。因此本文利用高效液相色譜分析技術，以蒙根竅吉散中主要藥效成分槲皮素、異鼠李素及兒茶素為考察指標，建立了含量測定方法，該方法簡單快捷，結果準確可靠，為提高蒙藥蒙根竅吉散的質量標準水平提供了借鑒和參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Agilent 1120液相色譜儀、EZChrom Elite色譜工作站；Thermo Fisher ScientificUltiMate3000高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；METTLER TOLEDO AB-135S型電子分析天平、FA1104型電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；KT-300 TDV型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MILLI-Q 超純水制備儀(Millipore，Bedford，MA)；VDRTEX-5渦旋混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；微量移液器(Eppendorf，Germany)。

1.2 試藥

對照品槲皮素(批號100081-201610，純度>99%)、異鼠李素(批號110860-201410，純度>99%)、兒茶素(批號100081-201610，純度>94%)均購自中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇、乙腈、醋酸均購自Fisher公司(Nepean，Ont.，Canada)；磷酸、鹽酸試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水，制備于Milli-Q超純水儀(Millipore，Bedford，MA)。

3批蒙根竅吉散均為額濟納旗蒙醫(yī)院院內制劑(批號分別為20170103、20170108、20170116)；沙棗果陰性對照供試品：按處方比例以相同工藝制備缺沙棗果的陰性對照供試品；鎖陽陰性對照供試品：按處方比例以相同工藝制備缺鎖陽的陰性對照供試品。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

槲皮素、異鼠李素混合對照品溶液：分別精密稱取對照品槲皮素、異鼠李素各7 mg于50 mL棕色容量瓶中，加入甲醇使其溶解，并定容至刻度，制槲皮素、異鼠李素質量濃度分別為141.9、140.5 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

兒茶素對照品溶液：精密稱取兒茶素對照品1.5 mg于25 mL棕色容量瓶中，加穩(wěn)定溶液(分別取新鮮配制的0.03 mol·L乙二胺四乙酸溶液25 mL、0.06 mol·L-1抗壞血酸溶液25 mL、乙腈50 mL，至500 mL量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，即得)使其溶解，并定容至刻度，制得質量濃度為580.0 μg·mL-1兒茶素對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

供試品a(用于檢測槲皮素、異鼠李素)：精密稱取樣品及沙棗果陰性對照供試品2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(10∶1)混合溶液50 mL，密塞，稱定重量，靜置30 min。置60 ℃水浴超聲處理1 h(功率為250 W，頻率為50 kHz)，放冷，再稱定重量，用甲醇-鹽酸(10∶1)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

供試品b(用于檢測兒茶素)：精密稱取樣品及鎖陽陰性對照供試品2.0 g，置50 mL量瓶中，加70%甲醇25 mL，70 ℃水浴浸泡10 min，超聲處理(功率為250 W，頻率為50 kHz)20 min，放冷，加穩(wěn)定溶液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

槲皮素、異鼠李素含量測定色譜條件：Diamonasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.4%磷酸水(47∶53)等度洗脫；流速：1 mL·min-1；柱溫為25 ℃；檢測波長為370 nm；進樣量為10 μL。

兒茶素含量測定色譜條件：Agilent ZORBAX C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以乙腈-乙酸-0.03mol·L-1乙二胺四乙酸-水(9∶2∶0.2∶88.8)溶液為流動相A；乙腈-乙酸-0.03 mol·L-1乙二胺四乙酸-水(80∶2∶0.2∶17.8)溶液為流動相B，按表1中規(guī)定進行梯度洗脫[1]；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：278 nm；進樣量：10 μL。

表1 兒茶素含量測定梯度洗脫條件

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照供試品溶液各10 μL，在2.3色譜條件下分別測定。結果顯示，沙棗果陰性對照供試品溶液、鎖陽陰性對照供試品溶液在與槲皮素、異鼠李素混合對照品、兒茶素對照品及供試品溶液色譜相應保留時間處未出現(xiàn)干擾色譜峰，表明在本實驗條件下槲皮素、異鼠李素、兒茶素與其他組分峰完全分離，專屬性強。色譜圖見圖1。

注：A1.沙棗果陰性對照供試品；B1.對照品；C1.供試品a；1.槲皮素；2.異鼠李素；A2.鎖陽陰性對照供試品；B2.對照品；C2.供試品b；3.兒茶素。圖1 陰性對照供試品、對照品及蒙根竅吉散供試品HPLC圖

2.4.2 線性關系 在2.3槲皮素、異鼠李素含量測定色譜條件下，分別精密吸取槲皮素、異鼠李素混合對照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積(Y)與對照品進樣量(X)進行線性回歸，得到槲皮素和異鼠李素回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍。結果見表2，表明槲皮素在0.283 8～1.419 1 μg，異鼠李素在0.280 9～1.404 6 μg線性關系良好。

在2.3兒茶素含量測定色譜條件下，分別精密吸取兒茶素對照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積(Y)與對照品進樣量(X)進行線性回歸，得到兒茶素回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍。結果見表2，表明兒茶素在0.115 5～1.155 5 μg線性關系良好。

表2 槲皮素、異鼠李素、兒茶素的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍

2.4.3 精密度試驗 精密吸取2.1項下的對照品溶液，按上述色譜條件下重復測定6次，結果槲皮素、異鼠李素、兒茶素峰面積的RSD分別為0.94%、0.63%、0.51%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取蒙根竅吉散樣品2.0 g，按2.2項下方法制備供試品溶液。在上述色譜條件下，分別于0、5、10、20、24 h進樣10 μL，記錄槲皮素、異鼠李素、兒茶素的峰面積，計算相對標準偏差。結果顯示，供試品槲皮素、異鼠李素、兒茶素的峰面積RSD分別為0.18%、0.89%、1.77%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 精密稱取2.0 g同一批號蒙根竅吉散樣品(批號：20170108)6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣10 μL，分別記錄槲皮素、異鼠李素、兒茶素的峰面積，計算平均含量的相對標準偏差RSD分別為0.87%、1.26%、1.69%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取1.0 g已知含量的樣品(批號：20170108)9份，分別精密加入適量的對照品溶液[2]，按2.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行測定，結果見表3。槲皮素、異鼠李素、兒茶素的加樣回收率RSD分別為92.05%、94.00%、91.25%(n=9)，表明本方法準確性高。

表3 蒙根竅吉散中槲皮素、異鼠李素、兒茶素的加樣回收率試驗(n=9)

2.5 樣品的含量測定

精密稱取不同批號蒙根竅吉散樣品各3份，按2.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，分別進樣10 μL測定，分別記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表4。由結果可知，按干燥品計算，槲皮素(C15H10O7)、異鼠李素(C16H12O7)、兒茶素(C15H14O6)平均含量分別為0.11、0.12、0.62 mg·g-1。

表4 蒙根竅吉散中槲皮素、異鼠李素及兒茶素的平均含量(n=3)mg·g-1

3 討論

蒙根竅吉散由沙棗、鎖陽等配方組成，其中沙棗果為方中君藥，所占處方比例較大，具有強壯、鎮(zhèn)靜、固精、健胃、止瀉等功能。其化學成分主要有：揮發(fā)油、生物堿、黃酮、芳香族、酚酸類成分(沒食子酸、咖啡酸等)、鞣質、糖類(還原糖、蔗糖)、蛋白質、氨基酸、脂肪、淀粉、粗纖維、總酸、維生素和礦物質等[3]。通過文獻分析，槲皮素和異鼠李素的藥理作用與沙棗的主要藥理作用相吻合[4]，推斷槲皮素和異鼠李素是沙棗的主要活性成分之一，因此把二者作為沙棗的指標性成分，進行了HPLC含量測定方法研究，效果較理想。經(jīng)分析方法驗證，表明該方法重復性好、專屬性強，方中其他組分對槲皮素、異鼠李素的測定無干擾，故擬收入質量標準中。

鎖陽為方中臣藥，亦稱不老藥，歷來作為中醫(yī)常用的補腎壯陽藥，臨床用于補腎陽、精血、潤腸通便等[5]。其化學成分主要有：黃酮類化合物[(+)-兒茶素、(-)-兒茶素、表兒茶素、異槲皮苷、柑桔素等]

三萜類(熊果酸、乙酰熊果酸、齊墩果酸丙二酸半酯等)、糖和糖苷類、鞣質類、木脂素類、有機酸(沒食子酸、原兒茶素、琥珀酸等)、甾體類、揮發(fā)性成分、氨基酸類等[6]，根據(jù)其所含有的主要化學成分及其主要藥理作用，推斷其有效成分可能是兒茶素、熊果酸、多糖、鞣質等。通過大量文獻分析，兒茶素在鎖陽中含量較高，其藥理活性與鎖陽的主要藥理作用相吻合[7-8]，因此把兒茶素作為控制鎖陽藥材質量的指標性成分，對其進行了含量測定方法研究。經(jīng)分析方法驗證，方中其他組分對兒茶素的測定無干擾，但回收率偏低(約63%)。通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，兒茶素類成分之間互為同分異構體，在熱水浸提過程中有部分組分相互轉化，使測得結果含量偏低。經(jīng)反復摸測，供試品前處理過程中加入穩(wěn)定溶液后，發(fā)現(xiàn)該方法重復性好、專屬性強，回收率達90%以上，故擬收入質量標準中。

其他成分如粗多酚、粗多糖[9]，雖具有較廣的生物活性，但天然含量低、分離困難、質量標準不易控制、分子結構難以測定；鞣質可能具有非常好的藥理作用，但其是一類比較復雜的多元酚類化合物，更好的藥理作用還需進一步的實驗證明[10]。因此，未對以上成分作進一步分析。