種子類藥材中二氧化硫殘留量的滴定法檢測對比

陳建茹，董偉偉，焦曉林，彭娟，吳馨琰，蔣寧，韓雪，高微微*

(1.上海同濟(jì)堂藥業(yè)有限公司，上海 201707；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

硫磺熏蒸是部分中藥材傳統(tǒng)加工和保管養(yǎng)護(hù)的常用方法，硫熏時(shí)產(chǎn)生的二氧化硫具有干燥、漂白、防霉、防蟲和延長貯藏期等作用[1]。近年來，藥材中殘留的二氧化硫?qū)θ梭w健康帶來的危害引起廣泛關(guān)注[2-4]。2005年版《中華人民共和國藥典》刪除了山藥、葛根和湖北貝母3個(gè)品種中硫磺熏蒸的加工方法[5]，并于2008年增補(bǔ)本開始收載了酸蒸餾-碘滴定法(Iodine Titration，IT法)測定二氧化硫殘留量[6]；2010年版《中華人民共和國藥典》將該檢測方法收錄于附錄IX U[7]；2012年發(fā)行的第一增補(bǔ)本對方法進(jìn)行了修訂[8]；2013年發(fā)行的第二增補(bǔ)本首次對中藥材及飲片二氧化硫殘留量進(jìn)行了限定，規(guī)定除山藥、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白術(shù)、黨參10種中藥材及其飲片中二氧化硫殘留量不得超過400 mg·kg-1以外，其他非礦物類中藥材及飲片二氧化硫殘留量不得超過150 mg·kg-1[9]。2015年版《中華人民共和國藥典》延續(xù)了上述規(guī)定，同時(shí)將第四部通則2331收錄的測定二氧化硫殘留量的滴定法由IT法改為酸堿滴定法(Acid-base titration，ABT法)[10]。目前，雖然IT法不再被藥典收錄，但與現(xiàn)行的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中二氧化硫的測定(GB 5009.34—2016)》較為類似[11]，近兩年的文獻(xiàn)中仍有研究者用于檢測中藥材、食品等[12-13]，IT法與ABT法對樣品測定結(jié)果的影響尚未見報(bào)道。

采用硫磺熏蒸的藥材品種多為不易干燥及易蟲蛀霉變或褐變的根及根莖類、花類以及動物性藥材[14-15]，種子類藥材較少使用硫熏工藝。我們前期在樣品檢測中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)深色種子類藥材很少檢出二氧化硫，但十字花科的藥材具有特殊性，未經(jīng)硫熏的藥材利用IT法仍能檢測到二氧化硫。由于十字花科的中藥材大多含有硫代葡萄糖苷(硫苷)類化合物及其降解產(chǎn)物[16-17]，這些含硫化合物的存在對二氧化硫殘留量測定結(jié)果可能會產(chǎn)生影響。本文采用IT、ABT兩種滴定法，對7種種子類藥材共100個(gè)批次樣品進(jìn)行二氧化硫含量測定；對其中二氧化硫檢出率較高的十字花科種子類藥材萊菔子與芥子，選取同一批藥材樣品對比兩種滴定法檢測結(jié)果的差異，并采用ABT法比較藥材炒制前后的二氧化硫含量，為種子類藥材的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試藥材

于2014—2018年期間收集7種種子類藥材共100個(gè)批次的樣品，包括萊菔子7個(gè)批次，炒萊菔子6個(gè)批次，芥子8個(gè)批次，炒芥子4個(gè)批次，沙苑子12個(gè)批次，紫蘇子7個(gè)批次，急性子5個(gè)批次，女貞子26個(gè)批次，補(bǔ)骨脂25個(gè)批次。每份樣品各取50 g左右，粉碎，過80目篩，于樣品收集后的3天內(nèi)完成二氧化硫殘留量的檢測。

1.2 儀器與試劑

電子天平(FA2004B，0.000 1 g，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)，粉碎機(jī)(111B，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)，可調(diào)溫電熱器(TC-15，海寧市華星儀器廠)，磁力攪拌器(H05-1，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)，25 mL酸式滴定管，10 mL堿式滴定管，碘滴定液(0.01 mol·L-1)，氫氧化鈉滴定液(0.01 mol·L-1)，甲基紅指示劑(2.5 mg·mL-1乙醇溶液)，氮?dú)?純度99.99%)，鹽酸、可溶性淀粉均為分析純。

1.3 碘滴定法(IT法)

參照2010年版《中華人民共和國藥典》第一增補(bǔ)本附錄IX U項(xiàng)下“碘滴定法”進(jìn)行。精密稱取藥材粉末10 g，置兩頸圓底燒瓶中，加水400 mL，在刻度分液漏斗中加入6 mol·L-1鹽酸溶液10 mL，錐形瓶內(nèi)加入水125 mL和淀粉指示液1 mL作為吸收液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌。打開冷凝管，在其上端連接導(dǎo)氣管置于錐形瓶內(nèi)。連接氮?dú)庠O(shè)置氣體流量為0.20 L·min-1。將分液漏斗中的10 mL鹽酸加至兩頸燒瓶中，加熱至沸，保持微沸約3 min后開始用碘滴定液滴定，至藍(lán)色或藍(lán)紫色持續(xù)30 s不完全消褪，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 mL滴定液相當(dāng)于0.640 6 mg的二氧化硫。

1.4 酸堿滴定法(ABT法)

參照2015年版《中華人民共和國藥典》四部項(xiàng)下“酸堿滴定法”進(jìn)行。以50 mL 3%過氧化氫溶液作為吸收液，使用前，在吸收液中加入3滴甲基紅乙醇溶液指示劑，并用0.01 mol·L-1氫氧化鈉滴定液滴定至黃色。與IT法采用相同的方式加熱，氣體流量為0.20 L·min-1，兩頸燒瓶中的溶液沸騰后保持微沸1.5 h后，停止加熱。將吸收液放冷，置于磁力攪拌器上不斷攪拌，用氫氧化鈉滴定液滴定至黃色持續(xù)時(shí)間20 s不褪，并將滴定的結(jié)果用空白實(shí)驗(yàn)校正。每1 mL滴定液相當(dāng)于0.32 mg的二氧化硫。

1.5 兩種滴定法檢測萊菔子、芥子的對比實(shí)驗(yàn)

選取2個(gè)批次萊菔子及2個(gè)批次芥子樣品，精密稱取藥材粉末10 g，分別用IT法、ABT法檢測二氧化硫的含量，每批次樣品重復(fù)測定2次。

1.6 萊菔子及芥子炒制前后二氧化硫含量測定

選取3個(gè)批次萊菔子及3個(gè)批次芥子樣品，采用ABT法檢測炒制前后藥材中的二氧化硫含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20軟件中的配對t檢驗(yàn)法比較兩種滴定法的檢測結(jié)果、藥材炒制前后的二氧化硫檢測數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同批次種子類藥材二氧化硫檢測結(jié)果

2014—2015年參照2010年版《中華人民共和國藥典》第一增補(bǔ)本，利用IT法檢測了49個(gè)批次種子類藥材的二氧化硫殘留量。表1中列出了有檢出的13個(gè)批次的結(jié)果，其中來源于十字花科的種子類藥材萊菔子、芥子二氧化硫的檢出率高達(dá)100%，且檢出量均超出2010年版《中華人民共和國藥典》增補(bǔ)版限量標(biāo)準(zhǔn)(≤150 mg·kg-1)。檢出量最高的樣品二氧化硫含量高達(dá)1650 mg·kg-1(炒萊菔子150501)。其他5種非十字花科的37批種子類藥材僅1批次沙苑子檢出二氧化硫(表1)，其余5批次沙苑子、3批次紫蘇子、3批次急性子、9批次女貞子、16批次補(bǔ)骨脂均未檢出。

2015年版《中華人民共和國藥典》實(shí)施之后，自2015年11月起采用ABT法檢測了51個(gè)批次種子類藥材的二氧化硫殘留量。其中13批十字花科萊菔子(7批)、炒萊菔子(1批)、芥子(4批)、炒芥子(1批)二氧化硫的檢出率為53.8%，僅1批次的炒芥子(151201)超出2015年版《中華人民共和國藥典》限量標(biāo)準(zhǔn)，檢出量為256 mg·kg-1(表1)。其他5種非十字花科的38批種子類藥材，僅1批次補(bǔ)骨脂檢出二氧化硫(表1)，其余6批次沙苑子、4批次紫蘇子，2批次急性子、17批次女貞子、8批次補(bǔ)骨脂均未檢出。

表1 不同批次種子類藥材二氧化硫測定陽性樣品及測定結(jié)果

注：ND表示未檢出；—表示產(chǎn)地未知。

2.2 兩種滴定法對萊菔子、芥子檢測結(jié)果的對比

對于二氧化硫檢出率較高的十字花科種子類藥材萊菔子、芥子，采用配對t檢驗(yàn)分析對比IT法與ABT法的檢測結(jié)果。ABT法對2批次萊菔子、2批次芥子的檢測值均高于IT法，萊菔子的檢測結(jié)果高出42.8%、5.9%；芥子的檢測結(jié)果高出360%、178%。但配對t檢驗(yàn)的結(jié)果表明兩種滴定法的檢測結(jié)果無顯著差異(P>0.05，表2)。

表2 IT法與ABT法對萊菔子和芥子的測定結(jié)果對比

2.3 炒制對萊菔子、炒芥子二氧化硫檢出量的影響

采用ABT法檢測萊菔子、芥子炒制前后的二氧化硫含量，萊菔子炒制前后的數(shù)據(jù)配對t檢驗(yàn)P值為0.872，表明炒制前后結(jié)果無顯著差異(P>0.05，表3)；芥子炒制前后配對t檢驗(yàn)P值為0.032，表明炒制后二氧化硫檢出量顯著高于炒制前(P<0.05)。

表3 萊菔子和炒芥子炒制前后二氧化硫的檢出量

注：ND表示未檢出。

3 討論

硫磺熏蒸中藥材的過程中，硫磺燃燒產(chǎn)生二氧化硫，與藥材中的水分結(jié)合生成亞硫酸鹽等物質(zhì)，殘留在中藥材中[18]。兩種滴定法的反應(yīng)原理均為利用亞硫酸鹽與鹽酸在加熱條件下生成二氧化硫氣體，通過吸收液進(jìn)行收集，再用滴定液進(jìn)行滴定并計(jì)算。種子類藥材在收獲后不用硫熏，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙苑子、紫蘇子、急性子、女貞子、補(bǔ)骨脂等非十字花科種子類藥材均未檢出二氧化硫殘留，而十字花科種子類藥材萊菔子、芥子大部分樣品中均能檢出二氧化硫，原因在于萊菔子含有蘿卜苷和萊菔子素，芥子含有白芥子苷、芥子堿硫氰酸鹽等硫苷及其衍生物[19-20]，這些含硫化合物在加熱情況下也可降解生成二氧化硫[21]，從而導(dǎo)致陽性結(jié)果，并不代表藥材用硫熏蒸過。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，2015年11月之前利用IT法檢測的5批次炒萊菔子二氧化硫含量均高于400 mg·kg-1，而2015年11月之后用ABT法檢測的7批萊菔子有檢出的批次二氧化硫含量均在106 mg·kg-1以下，原因一方面與炒制有關(guān)，另一方面與兩種方法本身的差異有關(guān)。對同一批芥子的炒制結(jié)果證實(shí)芥子炒制后二氧化硫檢出量顯著升高(P<0.05)，原因可能是炒制導(dǎo)致藥材中含硫成分轉(zhuǎn)化造成的[22]。另外，十字花科種子類藥材中硫苷類成分含量還與藥材產(chǎn)地、品種等有關(guān)[23-25]，可能也是不同批次十字花科種子類藥材二氧化硫檢出量存在差異的原因。

IT法與ABT法的差異在于吸收液與滴定液不同，加熱時(shí)間也存在差異，IT法邊加熱邊滴定，加熱時(shí)間受樣品釋放二氧化硫的總量與速率有關(guān)，而ABT法的加熱時(shí)間固定為1.5 h。本研究結(jié)果表明，ABT法對萊菔子、芥子的檢測結(jié)果高于IT法，推測可能的原因與兩方法中加熱時(shí)間不同，樣品中硫苷分解生成的二氧化硫量有差異有關(guān)，但兩種方法的檢測結(jié)果未達(dá)到顯著差異(P>0.05)。兩種方法的差異需進(jìn)一步增加樣本量確認(rèn)。另外，2015版《中華人民共和國藥典》除滴定法以外，還增加了離子色譜法與氣相色譜法，這3種方法中以滴定法操作最為簡便，成本也最低，應(yīng)用較為普遍，其他兩種方法受儀器昂貴、技術(shù)要求高、樣品前處理復(fù)雜的限制，多出現(xiàn)在研究報(bào)道中，在生產(chǎn)企業(yè)中應(yīng)用較少[26]。從檢測結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性考慮，在今后的工作中有必要對3種方法在十字花科藥材上應(yīng)用的一致性進(jìn)行確認(rèn)。