HPLC測(cè)定毛蕊花糖苷原料藥含量的不確定度評(píng)估△

毛樂(lè)靜，霍仕霞，孔征，譚雪，閆明

(1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆 烏魯木齊 830049)

毛蕊花糖苷為苯乙醇苷類(lèi)化合物，具有抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抗老年癡呆等作用[1-2]。筆者課題組已從新疆特色資源管花肉蓯蓉中提取分離純化制備得到了高純度的毛蕊花糖苷原料藥，建立可靠的質(zhì)控方法是保證該原料藥質(zhì)量的關(guān)鍵，筆者依據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部肉蓯蓉含量測(cè)定項(xiàng)下方法，進(jìn)行了毛蕊花糖苷原料的含量測(cè)定，在測(cè)定的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該方法存在很多不確定的因素，在稱(chēng)量、溶液稀釋、測(cè)定及方法學(xué)考察等每一個(gè)環(huán)節(jié)都存在不確定的因素，這些不確定的因素造成最終的測(cè)量值都會(huì)存在不能肯定的部分，稱(chēng)為不確定度[3]。不確定度與隨機(jī)性、模糊性、不完全性有關(guān)。測(cè)量的不確定度在分析化學(xué)領(lǐng)域是一個(gè)非常重要的概念，是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信賴(lài)程度的指標(biāo)。為了增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性，需要將其更加廣泛地應(yīng)用到分析實(shí)驗(yàn)中[4]。作者針對(duì)毛蕊花糖苷原料藥含量測(cè)定每個(gè)環(huán)節(jié)存在的不確定因素進(jìn)行分析，并對(duì)每個(gè)環(huán)節(jié)所產(chǎn)生的不確定度加以歸納，從中分析各個(gè)環(huán)節(jié)的不確定度對(duì)最終測(cè)定結(jié)果的影響，評(píng)估該含量測(cè)定方法的可靠可信度，使含量測(cè)定結(jié)果更有意義，為毛蕊花糖苷原料藥質(zhì)量控制和客觀評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀：LC-20 AB泵，SPD-M 20 A二極管陣列檢測(cè)器，CBM-20 A系統(tǒng)控制器，CTO-20 A柱溫箱，SIL-20 A自動(dòng)進(jìn)樣器，DGU-20 A3在線脫氣裝置；SQP-224-1CN天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SK 8210 HP型超聲清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

1.2 材料

毛蕊花糖苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111530-201208，純度：92.5%)；甲醇：HPLC級(jí)，Sigma-Aldrich公司；水為超純水；甲酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20140818)。

毛蕊花糖苷原料藥(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，批號(hào)：20130228、20130311、20130323、20130405、20130417、20130426、20130511、20130520、20130526、20130611)。

2 方法

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm[5]；流動(dòng)相：甲醇-0.2%甲酸水溶液(35∶65)[6]；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；在上述條件下進(jìn)樣分析，毛蕊花糖苷與其他組分實(shí)現(xiàn)基線分離，分離度大于1.5，理論板數(shù)大于3000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取毛蕊花糖苷對(duì)照品20 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相[甲醇-0.2%甲酸溶液(35∶65)]稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.8 mg毛蕊花糖苷的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取毛蕊花糖苷原料藥20 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，搖勻，精密吸取5 mL至10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取上述對(duì)照品溶液適量，分別制成毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度為5、10、20、40、60、80、120 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，分別以對(duì)照品溶液濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸處理，得毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=207 67X-1 329.5，r=0.999 6，線性范圍為5～120 μg·mL-1，結(jié)果表明在5～120 μg·mL-1毛蕊花糖苷峰面積與質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度考察

取毛蕊花糖苷原料藥供試品(批號(hào)：20130228)6份，按供試品項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，照含量測(cè)定色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.3%(n=6)。

2.6 穩(wěn)定性考察

取同一批毛蕊花糖苷原料藥樣品(批號(hào)：20130228)，處理?xiàng)l件分別為室溫和4 ℃冷藏，分別于0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96 h進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果室溫放置條件下RSD為1.2%(n=12)，冷藏條件下RSD為1.4%(n=12)，表明供試品溶液在96 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 檢測(cè)限及定量限測(cè)定

配制質(zhì)量濃度適當(dāng)?shù)拿锘ㄌ擒諏?duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL，當(dāng)信噪比S/N為3時(shí)，其檢測(cè)質(zhì)量濃度約為0.120 0 μg·mL-1；當(dāng)信噪比S/N為10時(shí)，其定量限為0.375 0 μg·mL-1。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取毛蕊花糖苷原料藥同一批樣品(批號(hào)：20130228)，配制低、中、高3個(gè)水平的溶液，平行3份。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的供試品溶液加樣回收率分別為101.1%、98.2%、99.5%(n=3)，平均加樣回收率為99.6%(n=9)，RSD為1.8%。

2.9 樣品含量測(cè)定

制備10批樣品，按供試品溶液制備法處理，按2.1色譜條件下測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，得樣品平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%。

3 不確定度分析

用GUM法評(píng)定測(cè)量不確定度的一般流程：分析不確定度來(lái)源和建立測(cè)量模型→評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)不確定度→計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度→確定擴(kuò)展不確定度→報(bào)告測(cè)量結(jié)果[7]。

3.1 不確定度來(lái)源

高效液相色譜法測(cè)定分析過(guò)程中的不確定度主要來(lái)源于幾個(gè)方面：稱(chēng)量過(guò)程、稀釋過(guò)程、儀器、對(duì)照品純度、回收率、標(biāo)準(zhǔn)曲線以及其他因素[8-9]。如圖1所示。

圖1 不確定度來(lái)源分析

3.2 數(shù)學(xué)模型的建立

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)毛蕊花糖苷原料藥進(jìn)行含量測(cè)定，毛蕊花糖苷含量計(jì)算公式如下[10]：

(1)

式中：X為樣品中毛蕊花糖苷含量(mg·g-1)；C樣為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求算的樣品質(zhì)量濃度(mg·L-1)；P對(duì)為對(duì)照品的純度(%)；V樣為樣品稀釋體積(mL)；W樣為供試品的取樣量(g)；D為對(duì)照品溶液的稀釋倍數(shù)；R為方法回收率。

3.3 各不確定度的分析和評(píng)定

(2)

式中：p對(duì)為對(duì)照品純度。

3.3.2 稱(chēng)量引入的不確定度(B類(lèi)不確定度) 對(duì)照品與樣品稱(chēng)量引入的不確定度[12]：稱(chēng)量使用SQP-224-1 CN天平(稱(chēng)量范圍220 g，精度0.1 mg)，稱(chēng)樣量分別為20 mg。

(3)

(4)

(5)

式中：u1為天平示值的不確定度；u2為天平稱(chēng)量重復(fù)性引入的不確定度；u為天平引入的不確定度；urel(w)為天平稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；m為質(zhì)量。

吸量管的不確定度：配制對(duì)照品溶液需使用1.0、2.0、5.0 mL吸量管，20 ℃時(shí)1.0、2.0、5.0 mL A級(jí)吸量管的允差分別為±0.008、±0.012、±0.025 mL[14]。配制對(duì)照品溶液由吸量管引入的不確定度按公式(7)計(jì)算得為3.278×10-3。

溫度的不確定度：容量器皿校準(zhǔn)溫度為20 ℃，實(shí)驗(yàn)室溫度為25 ℃，(20±5)℃時(shí)水的體積膨脹系數(shù)為2.080×10-4。故對(duì)照溶液配制過(guò)程中由溫度引入的不確定度按公式(8)計(jì)算得為6.467×10-5。對(duì)照品溶液稀釋過(guò)程引入的相對(duì)不確定度按公式(9)計(jì)算得為3.316×10-3。

(6)

(7)

(8)

(9)

式中：urel(V對(duì))為容量瓶體積引入的不確定度；n為稀釋次數(shù)；u10為10 mL容量瓶引入的不確定度；u25為25 mL容量瓶引入的不確定度；urel(Vp)為吸量管引入的不確定度；urel(VT)為溫度對(duì)容量瓶影響引入的不確定度；u(T25)為溫度對(duì)25 mL容量瓶影響引入的不確定度；u(T10)為溫度對(duì)10 mL容量瓶影響引入的不確定度；u對(duì)為對(duì)照品溶液稀釋引入的不確定度。

3.3.4 樣品稀釋過(guò)程引入的不確定度(B類(lèi)不確定度) 容量瓶體積的不確定度[15]：20 ℃時(shí)100 mL容量瓶的容量允差為±0.1 mL。由容量瓶引入的相對(duì)不確定度為4.082×10-4。由溫度引入的不確定度為6.004×10-6。由溫度引入的不確定度可忽略不計(jì)，樣品稀釋過(guò)程引入的相對(duì)不確定度為4.082×10-4。

3.3.5 與標(biāo)準(zhǔn)曲線有關(guān)的不確定度(A類(lèi)不確定度) 采用表1數(shù)據(jù)按公式(10)和公式(11)得出Y=20 767X-1 329.5(Y表示峰面積，X表示質(zhì)量濃度)，r=0.999 6，則峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)殘差s為11 808.99，n=7[16]。

應(yīng)用該曲線測(cè)量時(shí)，重復(fù)3次測(cè)量樣品處理液，即p=3，測(cè)得樣品平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%。

表1 毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液的HPLC峰面積

(10)

sxx=∑(cj-ca)2=24 245.618 62

(11)

(12)

(13)

式中：s為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)殘差，b1為斜率，p為樣品的測(cè)定次數(shù)，n為標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點(diǎn)個(gè)數(shù)，c0為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的樣品濃度，ca為制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的算術(shù)平均濃度，cj為校正曲線的單點(diǎn)濃度；c為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均值；sxx為殘差平方和；yi為峰面積；xi為濃度。

由公式(12)和公式(13)計(jì)算得到的不確定度和相對(duì)不確定度為0.402 9和9.101×10-3。

3.3.6 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度(A類(lèi)不確定度)

3.3.6.1 對(duì)照品溶液色譜峰面積的相對(duì)不確定度 取20 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次[17]，記錄峰面積分別為379 605、379 402、379 682、369 503、379 554、379 632。

(14)

(15)

(16)

平均峰面積A為377 896，RSD=1.1%。標(biāo)準(zhǔn)偏差按公式(15)計(jì)算得為4041，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差按公式(14)計(jì)算得為1649。對(duì)照品溶液相對(duì)不確定度按公式(16)計(jì)算得為4.446×10-3。

3.3.6.2 樣品溶液色譜峰面積的相對(duì)不確定度 制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，峰面積分別為410 489、413 273、410 655、411 122、413 165、399 500，平均峰面積為409 700，RSD為1.3%。標(biāo)準(zhǔn)偏差為366 835，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為149 759，按公式(17)計(jì)算引入的不確定度為5.124×10-4。

(17)

3.3.7 回收率的不確定度(A類(lèi)不確定度) 分別求算高、中、低質(zhì)量濃度的不確定度[18]。高質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為100.0%、99.1%、99.5%，中濃度的加樣回收率分別為97.6%、99.0%、98.0%，低濃度的加樣回收率分別為102.8%、102.2%、98.4%。高、中、低質(zhì)量濃度的RSD為0.468 0%、0.709 5%、0.235 0%，高質(zhì)量濃度：標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.465 7，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.268 9，引入的不確定度為1.911×10-3。中質(zhì)量濃度：標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.696 6，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.402 2，引入的不確定度為2.897×10-3。低質(zhì)量濃度：標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.376，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.372，引入的不確定度為9.594×10-4。

3.3.8 HPLC引入的相對(duì)不確定度(B類(lèi)不確定度) 島津高效液相色譜儀檢定證書(shū)給出定量測(cè)量重復(fù)性RSD為0.3%(n=6)[19]，按公式(18)計(jì)算得相對(duì)不確定為1.225×10-3。

(18)

3.3.9 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(U) 將上述不確定度分量依據(jù)含量計(jì)算公式，對(duì)不確定度合成，按公式(19)計(jì)算得不確定度為0.046 8，取包含因子k=2，此時(shí)對(duì)應(yīng)的置信概率為95%，毛蕊花糖苷原料藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.682，其擴(kuò)展不確定度為9.364。

(19)

3.4 不確定度分量

該方法引入的總體不確定度為0.046 8，各不確定度分量所占比重如表2所示，比重越高，說(shuō)明該因素引入的不確定度越大，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中需要嚴(yán)格控制。

表2 HPLC測(cè)定毛蕊花糖苷原料藥含量的不確定度評(píng)價(jià)

4 討論

4.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各不確定的分類(lèi)

不確定度指由于測(cè)量誤差的存在，對(duì)被測(cè)量值的不能肯定的程度，也表明測(cè)定結(jié)果的可信賴(lài)程度。不確定度越小，所述結(jié)果與被測(cè)量的真值愈接近，質(zhì)量越高，水平越高，其使用價(jià)值越高；不確定度越大，測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量越低，水平越低，其使用價(jià)值也越低[20-21]。在ISO指南中將這些不同種類(lèi)的分量分別劃分為A類(lèi)評(píng)定和B類(lèi)評(píng)定。本文中A類(lèi)不確定度包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度、測(cè)量重復(fù)性的不確定度、加樣回收率的不確定度；B類(lèi)不確定度包括對(duì)照品純度的不確定度、稱(chēng)量引入的不確定度、稀釋過(guò)程引入的不確定度、高效液相引入的不確定度。評(píng)估不確定度時(shí)，我們需要密切注意產(chǎn)生不確定度的所有可能來(lái)源，然后集中精力分析最大的不確定度分量。

4.2 降低不確定度的方法

本研究在對(duì)毛蕊花糖苷原料藥進(jìn)行含量測(cè)定的過(guò)程中，分析評(píng)價(jià)了從對(duì)照品配制到分析測(cè)定各個(gè)環(huán)節(jié)的不確定度，并分析了每個(gè)環(huán)節(jié)不確定度所占的比重，其中稱(chēng)量造成的不確定度比重最大，占到70%，取樣量的大小及所使用的分析天平的精度直接決定了不確定度的大小，分析時(shí)盡量在允許范圍內(nèi)，增大稱(chēng)樣量，選擇符合要求的容器；第二是含量測(cè)定過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線所產(chǎn)生的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度、標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、測(cè)定的峰面積不確定度，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線有一定的影響[22]；第三對(duì)照品和供試品測(cè)定過(guò)程中，色譜峰峰面積測(cè)定[23]、重復(fù)性及重現(xiàn)性考察等都會(huì)產(chǎn)生不確定度，這就要求分析人員在操作過(guò)程中，盡可能減少操作所造成的不確定；此外對(duì)照品的純度、稀釋過(guò)程、儀器允差[24]也會(huì)引入一定的不確定度，如配制溶液用到的移液管、容量瓶、稀釋的倍數(shù)、對(duì)照品的選擇，這些都是可以人為控制的因素。儀器選擇上，盡量選擇允差較小的設(shè)備。本研究的結(jié)果分析了毛蕊花糖苷原料藥含量測(cè)定過(guò)程中存在不確定度，旨在對(duì)分析中的不確定度有一個(gè)定性和定量的認(rèn)識(shí)，為后期優(yōu)化毛蕊花糖苷原料藥的質(zhì)控方法提供科學(xué)的依據(jù)。