乳酸菌用作口服疫苗表達載體的應用研究進展

亓秀曄，劉乃芝，程福亮，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑省級重點實驗室，山東 泰安 271000）

疫苗是用病原微生物（如細菌、立克次氏體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法，制成的用于預防傳染病的自動免疫制劑[1]。作為關乎人民群眾健康、公共衛(wèi)生安全及國家安全的特殊產(chǎn)品，接種疫苗在整個人類社會安全中起著重要作用。

活載體疫苗（live vector vaccine，LVV）是通過分子生物學手段將有效的目的抗原編碼基因?qū)牖钶d體（無或弱毒的細菌或病毒），從而構建重組菌（毒）株，使目的基因隨著重組菌（毒）株在宿主體內(nèi)的增殖而大量表達，從而誘發(fā)相應的免疫保護應答，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ男滦突蚬こ桃呙缰籟2]?；钶d體疫苗可誘導機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫，進而激發(fā)全身的黏膜免疫，具有特異性強、免疫效果持續(xù)穩(wěn)定、誘導位點專一、免疫方式簡單等優(yōu)點，而且如果載體中同時插入多個不同病原的外源基因，就能實現(xiàn)一免防多病的目的，這都是傳統(tǒng)疫苗無法比擬的優(yōu)勢。

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是在人體、動物、植物和整個自然界中廣泛分布的并公認的綠色安全級（generally regarded as safe，GRAS）微生物，是一群能大量發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細菌，分屬十幾個。LAB主要通過在機體腸道內(nèi)定植來改善腸道微生態(tài)環(huán)境，并具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏等益生作用及免疫調(diào)節(jié)等生理功效[3]。從21世紀初開始，國內(nèi)外學者就開始致力于對LAB分子生物學及作用機制的研究，以乳球菌（乳球菌、糞鏈球菌等）、乳桿菌（干酪乳桿菌、植物乳桿菌、拉曼乳桿菌、嗜酸乳桿菌等）和雙歧桿菌（長雙歧桿菌、金雙歧桿菌等）等作為基因工程受體菌，應用基因工程技術有目的、有選擇地研制新型微生態(tài)制劑，以更好的控制其益生性狀和免疫效果[4-5]。研究表明，像抗原、酶類、細胞因子、抗體、過敏原蛋白等一系列外源蛋白分子均可以在LAB中重組表達[6]。黏膜免疫的接種方式也是影響免疫效果的關鍵因素，消化道口服免疫和鼻腔免疫是目前重組乳酸菌疫苗使用最為廣泛的黏膜免疫方式，至于兩種免疫方式的效果比較目前還沒有定論[7-8]，但是兩種方式都可以通過胃腸黏膜進行抗原遞呈，經(jīng)不同的免疫通路產(chǎn)生與常規(guī)注射類似的免疫反應而產(chǎn)生的副作用遠小于后者，動物實驗和人體臨床實驗也驗證了基因工程LAB對于多種疾病預防和治療的有效性。

1 LAB用作口服疫苗活菌載體的優(yōu)勢

LAB作為外源基因表達宿主菌，其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在：（1）培養(yǎng)容易，操作方法（如電穿孔法轉(zhuǎn)基因）簡便，技術成熟，副作用少，成本低；（2）LAB作為GRAS益生菌，可直接口服，比一些減毒的載體更具有安全性，同時免去了目的蛋白的體外提純等后續(xù)加工處理工序。LAB在發(fā)揮自身益生功能的同時，增強免疫效果，一舉多得；（3）重組的LAB可用來表達不同類型的異源蛋白，比如嵌合的或非嵌合的抗原、細胞因子、各種酶等，同時還能將具有多種功能的藥物分子串聯(lián)表達，達到一免治多病的效果[9-11]；（4）可在細胞內(nèi)表達也可在細胞表面表達和分泌到胞外[12]；（5）LAB對機體黏膜有極強的粘附作用，因此進入消化道、呼吸道、泌尿系統(tǒng)等在黏膜處不斷繁殖，持續(xù)向機體釋放特異性的目的抗原蛋白[13]；（6）具有免疫佐劑作用、固有免疫原性及對膽汁酸的抵抗力，不需要額外地提供外源性抗原刺激動物機體就能發(fā)生黏膜免疫和系統(tǒng)免疫[14-15]。因此，LAB作為基因工程受體菌的應用前景十分廣闊。

2 LAB應用于活載體疫苗的研究

2.1 LAB載體分類及表達調(diào)控元件

許多LAB都被發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒的存在，且數(shù)量各異，1個或多個。脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）雜交和核苷酸序列分析證實，小質(zhì)粒同其他革蘭氏陽性菌的線性質(zhì)粒具有不同程度的同源性，一些LAB復制子宿主范圍廣泛，質(zhì)粒間可以進行頻繁的橫向傳遞和重組，因而可在其他種類的革蘭氏陽性菌及大腸桿菌中穿梭表達；此外，LAB質(zhì)粒多為滾環(huán)復制，質(zhì)粒分離相對穩(wěn)定，可在宿主體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的表達蛋白，LAB質(zhì)粒的這些特點有助于其在宿主體內(nèi)進行基因克隆和蛋白表達，因此，了解LAB的質(zhì)粒載體系統(tǒng)是研究基因工程乳酸菌的首要步驟。（1）克隆載體：LAB中研究的第一個克隆載體的構建是在2個廣宿主范圍的復制子pWV01和pSH71的基礎上發(fā)展起來的，后又逐漸衍生出許多新的質(zhì)粒；另外一個廣泛應用的復制子是從糞腸球菌中分離出的pAMbeta-1質(zhì)粒，后又衍生出pIL252和pIL253[16]質(zhì)粒。（2）表達載體：根據(jù)表達載體啟動子類型的不同，LAB表達載體可分為兩種類型：誘導型表達載體和組成型表達載體。目前應用最廣泛的誘導型表達系統(tǒng)是乳鏈菌肽受控的表達（nisin-controlled expression，NICE）系統(tǒng)，是由乳鏈菌肽nisin控制的食品級高效誘導表達系統(tǒng)，缺點是需要在免疫重組菌株之前提前誘導才會獲得高質(zhì)量的蛋白表達[17]，如ENOUF V等[18]用NICE系統(tǒng)表達產(chǎn)生輪狀病毒非結構蛋白4（rNSP4），可產(chǎn)生具有抗原和免疫原特性的rNSP4蛋白，且與病毒蛋白有相同的免疫原特性。組成型表達系統(tǒng)能夠持續(xù)穩(wěn)定的表達目的蛋白，不需要提前誘導，如從LAB中分離的組成型啟動子P32、P59和P23己成功地用于pMG76e、PVE5523和pOri23等組成型載體的構建[19]，如JEONG D W等[20]以pMG36e載體為基礎，使用來自于植物乳桿菌的半乳糖苷酶基因替代紅霉素抗性標記基因，成功的在乳酸乳球菌中構建了分泌性表達載體。相對而言，乳桿菌的表達載體由于遺傳多樣性等問題發(fā)展較緩慢，常用的乳桿菌的載體有pWV01、pSH71和pAMbeta-1等[21]。乳桿菌的表達載體同樣包括組成型啟動子如Ppgm、Pldhl、Ps1pA和誘導型啟動子[22]。

2.2 LAB表達載體調(diào)控元件的選擇性標記

LAB表達載體的調(diào)控元件即質(zhì)粒上都帶有一個或多個特定的選擇性標記基因。LAB選擇性標記主要分為兩類：非食品級標記和食品級標記。非食品級標記一般為常見的抗性篩選標記基因（如紅霉素、氯霉素、卡那霉素和氨芐青霉素等抗性基因），可選擇在加有這些抗生素的培養(yǎng)基里進行抗性壓力篩選，然而在全人類無抗時代，抗性基因的攜帶易造成潛在危害。隨著人們對食品安全問題日益重視，眾多學者一直致力于高效、無毒副作用的食品級表達載體的研究。常用的食品級表達載體主要有：糖誘導表達載體、噬菌體Φ31爆發(fā)式誘導的表達系載體、乳鏈球菌素調(diào)控表達載體、pH值調(diào)控表達載體等，這類表達系統(tǒng)的基因載體、受體及誘導物均為食品安全級，可直接口服免疫。

2.3 LAB表達載體的應用

2.3.1 LAB表達載體在動物疫病防控上的應用

做好動物疫病防控工作意義重大，關乎全人類健康和福利。流行性感冒（簡稱流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，傳播速度快，易造成人畜共患病，危害較大。流感病毒分為甲、乙、丙3種類型，其中甲型流感病毒極易變異，可引起反復流行或大流行，20世紀幾次著名的流感大流行均由甲型流感病毒引起[22]。甲型流感病毒的宿主范圍非常廣泛，它可以感染禽類、豬、馬、狗、海洋生物、哺乳動物和人類等，甲型流感病毒可以分為16種血凝素（hemagglutinin，HA）亞型（H1～H16）以及9種神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）亞型（N1～N9）[23]，各亞型在宿主之間有一定局限性。

其中豬流感（swine influenza，SI）的病原是豬流感病毒（swine influenza virus，SIV），屬于正粘病毒科、流感病毒屬、A型流感病毒[24]。目前沒有正規(guī)的SI的疫苗，預防困難，從分子方面著手是有效的措施。M2e是SI基質(zhì)蛋白M2胞外域的保守序列，包含24個氨基酸，M2e蛋白被認為可刺激機體產(chǎn)生免疫反應來應對多種流感病毒亞型的保護性抗原[25]。王倩[26]將植物乳酸菌NC8作為外源蛋白的遞送載體，將SIV主要保護性抗原M2e蛋白基因與小鼠的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）的Fc受體片段基因融合在一起，成功制備了含有pSIP409-3M2e-Fc的重組乳酸菌口服疫苗，并發(fā)現(xiàn)重組口服疫苗對小鼠有顯著的免疫效果（P＜0.05）。NS1蛋白是SIV基因組中唯一的非結構蛋白，保守性較高，具有可以加快病毒復制，擾亂宿主免疫系統(tǒng)的作用，并且由于其結構的獨特性可以用來到區(qū)分感染動物和免疫動物。YANG WT等[27]通過將NS1基因與穿梭載體相連構建重組質(zhì)粒pSIP409-pgsA-NS1并導入植物乳酸菌NC8，成功構建了新型功能乳酸菌口服疫苗，此款口服疫苗能提高感染SI病毒小鼠的存活率，對甲型流感病毒（H1N1）型SIV有一定的保護作用。這為SI的防治提供了有力證據(jù)。

禽流感（avian influenza，AI）的病原是禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）。目前常用的防控AI有效的途徑是疫苗，但由于AIV抗原容易變異易導致疫苗防控存在局限性，影響了疫苗的免疫效果。HA是AIV的血凝素，具有強烈的抗原性，HA2在AIV的各個亞型之間是相對保守的，是制備通用型疫苗的候選抗原。YOON A W等[28]進一步利用pgs A蛋白將HPV-16衣殼蛋白L2于干酪乳桿菌（L.casei）表面進行展示，證實該菌株除了能介導機體產(chǎn)生全面的免疫應答以外還能對多種其他亞型的乳頭瘤狀病毒產(chǎn)生交叉中和反應。為新型微生態(tài)制劑的研制提供了依據(jù)。SHIS H等[29]研究發(fā)現(xiàn)，口服表達甲型流感病毒（H9N2）HA的植物乳桿菌，誘導免疫小鼠產(chǎn)生糞便IgA、細支氣管IgA及血清免疫球蛋白，二級淋巴器官的B細胞水平也提高了，CD8+T細胞增殖水平和干擾素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）分泌水平有了很大的改進，相當于典型的流感疫苗的水平，最重要的是，致死量攻毒后免疫小鼠幸存下來；此作者在接下來的研究中利用樹突狀細胞誘導肽作為佐劑的試驗中也表現(xiàn)出了同樣的結果，口服表達甲型流感病毒（H9N2）HA的植物乳桿菌提高了免疫雞只的免疫應答和攻毒保護率[30]；WANG Z等[31-32]在BALB/c小鼠和雞上的甲型流感病毒（H5N1）HA1試驗中，抗體和T細胞水平出現(xiàn)一致的結果。LEIH等[33]將HA抗原成功展示重組乳酸乳球菌的菌體表面，重組菌單獨或和霍亂毒素單位B（cholera toxin subunit B，CTB）一起口服免疫實驗動物，然后對小鼠攻毒致死劑量的甲型流感病毒（H5N1）病毒，結果發(fā)現(xiàn)，在添加CTB的試驗組中檢測到了明顯滴度的HA特異性血清IgG以及糞便IgA，細胞增殖試驗和IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點試驗的結果揭示了細胞免疫應答的發(fā)生，更重要的是，CTB與重組乳酸菌聯(lián)合免疫組的小鼠能夠抵抗致死劑量的H5N1病毒感染。這與CHOWDHURY M Y E等[34]的研究結果一致，作者用表達霍亂毒素單位A（cholera toxin subunit A，CTA1）共軛基質(zhì)蛋白-2（conjugated consensus matrix protein-2，sM2）構建重組干酪乳桿菌，并將重組干酪乳桿菌對小鼠進行粘膜免疫，結果發(fā)現(xiàn)重組干酪乳桿菌是誘導小鼠對多種流感亞型產(chǎn)生保護性免疫應答。

仔豬病毒性腹瀉主要是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬輪狀病毒（porcine rotavirus，Po RV）單獨或混合感染引起，該病對仔豬的危害較大，病死率高[35-37]。3種病毒引起的發(fā)病豬臨床癥狀和病理變化都非常相似，并且常常存在混合感染，防止比較困難[37]。該3種病毒目前均沒有特效的藥物，單純靠疫苗接種并不能完全防治仔豬腹瀉。

TGEV與PEDV同屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus），S蛋白是TGEV與PEDV結構蛋白中唯一能誘導中和抗體的產(chǎn)生和提供免疫作用的蛋白。HO P S等[38-39]分別成功構建了以TGEV S蛋白為目的基因的TGEV重組干酪乳桿菌和nisin誘導型表達S蛋白的乳酸乳球菌，抗原蛋白均得到高效表達，口服重組菌免疫Balb/c小鼠檢測到血清中sIgG抗體和腸洗液IgA含量明顯升高，且抗體菌具有病毒中和活性，這些結果證明了所構建的重組菌能夠誘導免疫小鼠產(chǎn)生局部免疫和全身性免疫反應。趙艷麗等[40]將TGEV S1基因克隆到pMD18-T載體并成功電轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ3900中并表達了S1蛋白，表達產(chǎn)物具有反應原性，表達蛋白位于菌體表面；薛瑞雪[41]以SA基因為基礎，成功構建含有TGEV的A、D抗原位點和乳酸桿菌質(zhì)?；騌ep.8014的重組真核質(zhì)pRc/CMV2-SAD-Rep.8014并電轉(zhuǎn)到豬源乳酸桿菌中，口服重組菌疫苗能夠刺激機體產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細胞免疫，同時可以促進脾臟T淋巴細胞的增殖及IFN-γ、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）的產(chǎn)生，尤其在刺激產(chǎn)生黏膜抗體中具有顯著的刺激作用。KONJUFCA V等[42]以重組沙門菌和重組腺病毒作活載體構建PEDV疫苗，產(chǎn)生有效針對病毒的局部黏膜免疫應答和全身免疫反應；LIU D Q等[43]研究表明，通過表面表達PEDV S1蛋白和N蛋白（不是通過分泌），抗S1和抗N的抗體水平顯著增加，特別是在眼和鼻分泌物中；HOU X L等[44]在干酪乳桿菌表面表達了PEDV N蛋白，小鼠和豬口服重組PEDV N蛋白和S1蛋白的干酪乳桿菌后，雖然不產(chǎn)生中和抗體，但能激發(fā)高水平黏膜IgG、sIgA和非中和抗體的全身免疫反應。

輪狀病毒是引起嬰幼兒及其它多種動物如豬、羊、火雞等的脫水性腸胃炎的主要病原之一，輪狀病毒重組乳酸菌的保護作用的兩種主要途徑已經(jīng)在小鼠上得到驗證。第一個途徑是利用干酪乳酸菌進行典型的口服免疫，在小鼠體內(nèi)誘導產(chǎn)生了黏膜IgA和抵抗Po RV主要保護性抗原VP4的血清中和抗體IgG[45]；第二個途徑是利用抗體片段提供保護，ALVAREZ B等[46]在鼠李糖乳桿菌表面表達了一個抵抗RV的抗體片段，在幼鼠模型上產(chǎn)生了抗腹瀉的保護性。Po RV的VP4和VP7是刺激機體產(chǎn)生中和抗體的重要抗原。GAO S Y等[47]成功構建了表達Po RV的VP4蛋白和共表達VP4與大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位的重組乳酸乳球菌和干酪乳桿菌表達系統(tǒng)，口服免疫小鼠后，不僅可刺激局部腸道黏膜產(chǎn)生免疫應答，同時誘導產(chǎn)生了體液免疫應答和細胞免疫應答。周晗[48]成功構建了表達Po RV的VP7蛋白的重組干酪乳桿菌pPG-1-VP7/L.casei393，口服免疫小鼠，可誘導機體產(chǎn)生局部粘膜免疫應答和系統(tǒng)體液免疫應答；MARELLIB等[49]成功將RV蛋白VP8在細胞質(zhì)表達，分泌到細胞外并展示到菌體表面的重組乳酸桿菌并免疫小鼠，研究表明，口服免疫含有pL1質(zhì)粒乳酸菌（LL1）的小鼠產(chǎn)生了顯著水平的腸黏膜抗體而接種含有pL3質(zhì)粒乳酸菌（LL3）的小鼠則產(chǎn)生了腸黏膜和系統(tǒng)水平的抗VP8抗體，LL1免疫組的腸黏膜抗體的保護率達到50%，LL3免疫組的血清抗體保護率達到100%。這些令人鼓舞的結果描繪了輪狀病毒疫苗發(fā)展的新方向。

隨著生物技術的發(fā)展，越來越多的病毒群已經(jīng)利用乳酸菌載體系統(tǒng)進行靶向研究。例如，豬瘟病毒為豬的黃病毒屬，已經(jīng)在兔、小鼠和豬上進行了試驗，所有試驗顯示均產(chǎn)生了血清抗體和黏膜抗體，特別是在豬上的試驗中，胸腺素α-1和T細胞激活肽的出現(xiàn)，能夠提高IgG、IgA，IFN-γ、IL-2和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平[50]。豬細小病毒已經(jīng)在BALB/c小鼠和豬上進行過研究，出現(xiàn)明顯的IgG和IgA的反應，以及攻毒保護和病毒中和反應[51]。雞新城疫病毒是一種主要侵染家禽的副粘病毒科病毒，在細菌上增加了樹突狀細胞誘導肽（dendritic cell induc ing peptide，DC-pep）后，與未添加DC-pep相比，雞只產(chǎn)生了強的新城疫保護性免疫反應，不僅提高了粘膜和血清抗體水平，同時也增加了外周血和脾臟中的T輔助細胞水平[52]?？谔阋卟《荆粋€困擾偶蹄動物的小核糖核酸病毒，將口蹄疫病毒乳酸桿菌活載體疫苗口服免疫豚鼠，不但可以刺激機體產(chǎn)生較強的系統(tǒng)免疫應答，而且還誘導機體發(fā)生較強的黏膜免疫應答，攻毒保護性實驗證實該重組乳酸菌疫苗能夠在疾病發(fā)生的早期發(fā)揮防控作用[53]。

2.3.2 LAB在代謝產(chǎn)物調(diào)控方面的應用

LAB代謝產(chǎn)生乳酸及其他多種代謝產(chǎn)物，它們共同改善發(fā)酵食品特有的風味、質(zhì)地和營養(yǎng)價值。通過基因工程手段人為地加入或敲除某些基因來有效地增加或抑制某些代謝產(chǎn)物的形成，這為開發(fā)新功能型發(fā)酵食品具有重要意義。如在乳球菌丙酮酸代謝途徑中，敲除乳酸脫氫酶基因或過量表達NADH氧化酶，可以使乳酸菌大量地產(chǎn)生雙乙酰代替乳酸；在乳球菌中引入外源性基因如丙氨酸脫氫酶基因，可使乳酸菌大量產(chǎn)生L-丙氨酸代替丙酮酸。在乳球菌中過量地表達葉酸或核黃素生物合成的關鍵酶，可以促進這兩種B族維生素的生物合成；在對乳酸菌胞外多糖生物合成途徑中的限制性步驟如糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)生進行調(diào)控，可以有效地提高胞外多糖的產(chǎn)量。一些乳桿菌屬，已被用作具有促進健康特性的商業(yè)益生菌培養(yǎng)物[54]。楊歡等[55]將草酸脫羧酶（oxalate decarboxylase，ODC）和草酸氧化酶（oxalate oxidase，OXO）基因與表達質(zhì)粒pMG36e重組，通過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸菌MG1363中，成功構建重組pMG36e-ODC和pMG36e-OXO乳酸菌，兩者都可在含100 mmol/L草酸的培養(yǎng)液中生長，pMG36e-ODC重組乳酸菌喂養(yǎng)可顯著降低高草酸飲食大鼠尿液，中草酸含量，這對治療尿石癥提高重要理論依據(jù)。SANFéLIX-HAYWOODN等[56]將多糖代謝關鍵酶-α-磷酸葡萄糖變位酶基因pgm利用pT1NX表達載體電轉(zhuǎn)化到植物乳酸菌BL310中，成功使胞外多糖產(chǎn)量增加了172%；VAN K R等[57]將產(chǎn)胞外多糖代謝關鍵酶引導糖基轉(zhuǎn)移酶eps-D基因利用pNZ4055表達載體在乳酸球菌中過量表達，結果發(fā)現(xiàn)胞外多糖產(chǎn)量提高15%。除胞外多糖外，還有乳酸以及類黃酮等代謝物的生產(chǎn)。寇田田[58]在質(zhì)粒pMG36e的基礎上構建的pMG36e-dsred2基因工程菌，實現(xiàn)了一步法生產(chǎn)乳酸，提高了乳酸的產(chǎn)量。SCHUMANN C等[59]利用表達載體pSIP409將蘋果酸乳酸酶基因（mle）克隆到植物乳酸菌WCFS1中，發(fā)現(xiàn)重組菌加速了乳酸的發(fā)酵。LIU D Q等[43]利用載體pNZ8149將大豆查爾酮異構酶基因（CHI1A）進行克隆表達，為生產(chǎn)類黃酮奠定基礎。

3 結語與展望

LAB作為益生菌，其應用前景巨大，尤其是伴隨著基因工程技術逐漸的進步，構建LAB表達系統(tǒng)表達生物活性蛋白或傳遞外源保護性抗原的條件已逐漸完善。無抗時代的到來，LAB作為無抗性篩選標記的候選人責任重大，基因工程乳酸菌的安全問題涉及到全人類的食品安全觀念更是深入人心。首先，當前許多外源性抗原基因的表達都是在體外進行的，無法精確的模擬其體內(nèi)的表達及作用過程；其次，即使可以體外模擬外源抗性基因的表達，表達的抗原是否能夠與黏膜組織的免疫系統(tǒng)廣泛接觸，控制重組乳酸菌在動物消化道粘附和定植；再次動物機體免疫耐受力下降也是是將來研究的重點；此外，重組基因工程乳酸菌潛在的風險如致病性、抗藥基因轉(zhuǎn)移造成的感染、致病性細菌的過度繁殖和變異無法控制性等都需要考慮到。因此，怎么讓機體對表達所需抗原的乳酸菌都可以引起所需、高效持久的免疫應答等都是當前面臨的最大的問題?？上攵殡S著研究技術的不斷提高，我們將會獲得品質(zhì)更加良好的基因工程乳酸菌，這對于生產(chǎn)實踐的應用有著深遠的意義。