HPLC法測定黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的含量及包封率

付麗娜，李偉澤,趙 寧，李維鳳

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061；2.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，西安 710021)

黃藤素(palmatine)又名掌葉防己堿、巴馬汀、棕櫚堿和非洲防己堿等，是從防己科植物黃藤(FibraurearecisaPierre)的干燥藤莖中提取精制而得[1]。黃藤素具有明顯的抗炎抑菌作用，其抗真菌作用尤佳，還具有體外抗陰道毛滴蟲的活性，安全無毒[2-3]。但由于黃藤素脂溶性較差，生物利用度較低[4]，限制了其臨床應(yīng)用。納米柔性脂質(zhì)體具有較高的包封率和穩(wěn)定性[5-7]，粒徑多為數(shù)十至數(shù)百納米，外觀為膠體溶液。本實驗利用注入法制備黃藤素柔性納米脂質(zhì)體，建立黃藤素柔性納米脂質(zhì)體的含量及包封率測定方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ZEN-3600Malvern激光粒度儀(馬爾文公司)；Quintix224-1CN電子天平、SIGMA1-14離心機(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；52-AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；B11-1型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)；FJ-200高速分散勻質(zhì)機(上海標(biāo)本模型廠)；DDS-307電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器有限公司)；JEM-2000EX透射電鏡(日本電子株式會社)。

1.2試藥 黃藤素對照品(中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)；黃藤素(西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號XC20140304，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)；大豆卵磷脂(湖北遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司)；膽固醇(上海山浦化工有限公司)；1,2-丙二醇(廈門星鯊制藥有限公司)；硫酸魚精蛋白(Sigma公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的制備 稱取卵磷脂3.5 g與膽固醇0.02 g，用無水乙醇10 mL溶解，于-0.05 MPa、50 ℃條件下濃縮，以無水乙醇復(fù)溶至10 mL，形成油相。將1，2-丙二醇20 mL加入蒸餾水76 mL中混勻，得水相。取1/3水相，加黃藤素0.2 g溶解，并于50 ℃以100 r·min-1磁力攪拌將油相緩慢注入，水合5 min，以20 000 r·min-1均質(zhì)5 min，將剩余2/3水相加入，繼續(xù)高速均質(zhì)5 min，最后通過聚丙烯濾膜(0.22 μm)過濾2次，4 ℃保存?zhèn)溆肹8-9]。

取少量上述脂質(zhì)體混懸液，將稀釋液樣品適量滴于銅載網(wǎng)上，晾干后用質(zhì)量濃度為15 mg·mL-1的磷鎢酸進行負(fù)染色，于透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)(加速電壓2 kV，分辨率0.2 nm)，結(jié)果見圖1。另取適量黃藤素納米柔性脂質(zhì)體用蒸餾水稀釋，采用激光粒度儀測定其粒徑及表面Zeta電位。結(jié)果見圖2。

圖1黃藤素納米柔性脂質(zhì)體透射電鏡圖

Fig.1 The TEM images of palmatine-loaded flexible nano-liposomes

圖2黃藤素納米柔性脂質(zhì)體粒徑(A)和電位(B)分布圖

Fig.2 The size (A) and zeta potential (B) distribution of palmatine-loaded flexible nano-liposomes

由圖1可知，黃藤素納米柔性脂質(zhì)體外觀為圓形或橢圓形，內(nèi)部具有同心圓的指紋狀結(jié)構(gòu)，其原因可能是由于柔性脂質(zhì)體加入丙二醇后，使脂質(zhì)體雙分子膜的柔性和變形性提高[10]。由圖2可知，黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的粒徑集中在200 nm處，表面Zeta電位為-49.7 mV，當(dāng)Zeta電位的絕對值>30 mV時，納米粒表面存在大量凈電荷，納米粒間存在較大的靜電排斥力，有利于提高納米制劑的穩(wěn)定性[11-12]。因此，黃藤素納米柔性脂質(zhì)體囊泡彼此之間的靜電排斥力較大且具有較強的物理穩(wěn)定性。

2.2黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的含量與包封率測定

2.2.1試劑的配制 魚精蛋白：稱取硫酸魚精蛋白 0.1 g，用蒸餾水溶解，定容于10 mL量瓶中，即得質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的魚精蛋白溶液。

消解液：吸取Triton X-100 12 mL，用甲醇稀釋至100 mL，即得體積分?jǐn)?shù)為12%的Triton X-100甲醇溶液。

2.2.2色譜條件 Hypersil BDS C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱；流動相：乙腈(A)-0.4 mL·L-1磷酸(B)(20∶80)；檢測波長：345 nm[13-14]；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

2.2.3專屬性考察 對照品溶液的制備：精密稱取黃藤素對照品20 mg，置于10 mL量瓶中，用雙蒸水配制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的儲備液。精密量上述儲備液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流動相稀釋成質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1的溶液。

樣品溶液的制備：精確量取黃藤素納米柔性脂質(zhì)體1.0 mL，加入體積分?jǐn)?shù)為12% 的TritonX-100甲醇溶液2 mL，使脂質(zhì)體膜材溶解，用流動相定容至10 mL，以13 000 r·min-1離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。

陰性溶液的制備：按照2.1項下方法不加入黃藤素制得空白脂質(zhì)體溶液。吸取上述對照品儲備液1 mL，置于10 mL量瓶中，按照2.2.1項下消解液的制備方法，制得陰性溶液。

取上述3種溶液各20 μL，進樣，得HPLC圖。在該色譜條件下，黃藤素能達(dá)到基線分離且峰形穩(wěn)定，脂質(zhì)體及輔料不干擾黃藤素的測定。

2.2.4線性關(guān)系考察 精密稱取黃藤素對照品0.028 g，加蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為0.84，2.8，8.4，14.0和25.2 μg·mL-1的對照品溶液，精密移取各溶液20 μL，注入液相色譜儀中測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=94.637x-43.44(r=0.999 8)，結(jié)果表明，黃藤素在質(zhì)量濃度為0.84～25.2 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度測定 按照2.2.3項下方法配制高、中和低(25,13.95和0.8 μg·mL-1)3個質(zhì)量濃度的黃藤素對照品溶液，按照色譜條件測定峰面積，每日(0，2，4，6，8和10 h)進樣，測定峰面積，結(jié)果其日間和日內(nèi)精密度RSD值均小于2%。

2.2.6回收率測定 精密量取9份陰性溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，編號為1～9。每3份中分別精確加入2 mL高、中和低(25.2,14和0.84 μg·mL-1)3個質(zhì)量濃度的黃藤素對照品溶液，同時加入體積分?jǐn)?shù)為12%的Triton X-100甲醇溶液，搖勻后定容，以13 000 r·min-1離心5 min，取上清液，按照2.2項下方法測得RSD值為0.75%，結(jié)果見表1。

表1黃藤素回收率測定結(jié)果

Tab.1 Results of recovery test of palmatine

編號加入量/μg·mL-1測得量/μg·mL-1回收率/%平均回收率/%RSD/%12524.65298.60899.040.7522524.73598.94032524.85699.424413.9513.93199.863 80513.9513.92699.827 96613.9513.92299.799 2870.80.78598.12580.80.78397.87590.80.79198.875

2.2.7黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的含量測定 精密吸取黃藤素脂質(zhì)體0.75 mL，置于5 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為12%的Triton X-100甲醇溶液消解至澄清透明，搖勻，取20 μL進樣測定，即為脂質(zhì)體中黃藤素的含量。測定3個批次樣品，結(jié)果黃藤素質(zhì)量濃度分別為98.1，97.5和99.3 g·mL-1，RSD值為0.93%。

2.2.8黃藤素納米柔性脂質(zhì)體包封率的測定 精確量取黃藤素納米柔性脂質(zhì)體1.5 mL，置于5 mL離心管中，加入質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的魚精蛋白溶液1.5 mL，搖勻后靜置3 min，在室溫條件下以13 000 r·min-1離心10 min，見圖3；棄上清液，脂質(zhì)體沉淀物用體積分?jǐn)?shù)為12%的Triton X-100甲醇溶液2 mL消解至澄清[15]，取20 μL進樣測定，測定3批。包封率計算公式[16]：包封率=(W包封÷W總量)×100%，W包封為包封于脂質(zhì)體的藥物質(zhì)量濃度，W總量為實際加入的總藥量的質(zhì)量濃度。結(jié)果3批包封率分別為80.67%，77.88%和78.41%，RSD值為1.88%。

圖3魚精蛋白凝聚法沉淀黃藤素納米柔性脂質(zhì)體效果圖

Fig.3 The photo of precipitating palmatine-loaded flexible nano-liposomes with protamine aggregation method

蛋白質(zhì)對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響較為復(fù)雜，蛋白質(zhì)可鍵合或吸附在脂質(zhì)體表面，使脂質(zhì)體密度增大；也可部分插入雙分子脂質(zhì)層或穿透整個脂質(zhì)膜，從而影響其穩(wěn)定性[17]，由圖3可知，采用魚精蛋白法能使脂質(zhì)體與游離藥液明顯分離，且游離藥液澄清透亮。

3 討論

本文以丙二醇為柔軟劑，采用注入法制備黃藤素納米柔性脂質(zhì)體，制備過程中發(fā)現(xiàn)：黃藤素納米柔性脂質(zhì)體對藥物的包封率隨著丙二醇用量的增加而增大；當(dāng)丙二醇用量大于20 mL時，包封率開始逐漸降低，因此本次脂質(zhì)體制備的處方選用丙二醇用量為20 mL。

為了準(zhǔn)確測定黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的包封率，須將脂質(zhì)體和游離的藥物有效分離。常用葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法和超速離心法等分離脂質(zhì)體。其中葡聚糖凝膠柱色譜較為常用，但葡聚糖表面上許多位點能與脂質(zhì)體膜結(jié)合并相互作用，導(dǎo)致膜滲透性的改變和包裹物質(zhì)的滲漏且脂質(zhì)體易被稀釋；透析法過程緩慢，適合分離小分子物質(zhì)；超速離心法易破壞脂質(zhì)體，且對于小粒徑脂質(zhì)體特別是納米脂質(zhì)體分離效果較差[18-19]。魚精蛋白凝聚法主要是通過在脂質(zhì)體表面吸附某種蛋白質(zhì)來增加脂質(zhì)體的密度使游離藥物與脂質(zhì)體通過離心后達(dá)到有效分離。本文用約含2/3以上精氨酸的鮭魚精蛋白，是一種含有胍基的帶正電的堿性氨基酸[20-21]。黃藤素納米柔性脂質(zhì)體帶有負(fù)電荷。多聚陽離子魚精蛋白會與帶負(fù)電的脂質(zhì)體產(chǎn)生絮凝作用，并通過離心將脂質(zhì)體和游離藥物分離。實驗發(fā)現(xiàn)，不同體積的魚精蛋白溶液加入黃藤素納米柔性脂質(zhì)體，凝聚效果也有差異，魚精蛋白溶液加入過多，對脂質(zhì)體有稀釋作用，形成的脂質(zhì)體凝集量較少；魚精蛋白溶液加入過少，雖能有效分離脂質(zhì)體，但由于游離藥物溶液過少，不利于取樣分析。因此經(jīng)過多次實驗，最終加入與樣品量同體積的魚精蛋白溶液，能有效分離脂質(zhì)體和游離藥物，且利于取樣分析。

本實驗所建立的黃藤素分析方法精密度較高，變異系數(shù)較小，HPLC法結(jié)合魚精蛋白法可快捷、準(zhǔn)確地測定黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的含量和包封率，且專屬性強，輔料不會對主藥含量測定產(chǎn)生干擾，可用于黃藤素納米柔性脂質(zhì)體的質(zhì)量控制。