魚精蛋白制備與功能研究進展

朱 淞，高莉莉，呂 泉，蔣 丹，張 榮

（1. 大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連 116023；2. 鲅魚圈海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，遼寧營口 115020；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100093）

魚精蛋白（Protamine） 是一種堿性蛋白質(zhì)，存在于魚類的成熟精巢組織（魚白） 中，通常由大約30 個氨基酸組成，以精氨酸為主，分子量大多小于10 000 Da，等電點為10～12[1]。

魚精蛋白組成較為特殊，高比例的堿性蛋白序列賦予其不同于其他蛋白質(zhì)的獨特功能，具有廣譜、高效、安全的殺菌活性，是綠色、天然的食品防腐劑?；诹己玫慕Y(jié)合肝素的能力，魚精蛋白硫酸鹽成為體外循環(huán)心臟手術(shù)中唯一對抗肝素的藥物，在臨床上廣泛用于抗凝血劑的解毒劑[2-3]。魚精蛋白還具有抗疲勞、助呼吸、促消化、降血壓、抑制腫瘤生長等重要生理功能[4]。目前，魚精蛋白的作用機理尚不明確，限制了魚精蛋白的進一步應(yīng)用；由于精深加工技術(shù)的不成熟，魚精蛋白在水產(chǎn)加工企業(yè)未得到充分的開發(fā)利用。

主要對魚精蛋白制備技術(shù)及結(jié)構(gòu)與功能的研究進展進行綜述，以期為魚精蛋白的后續(xù)研究與開發(fā)利用提供參考。

1 魚精蛋白的分類

按堿性氨基酸組成分類，魚精蛋白可分為3 類：①單魚精蛋白，堿性氨基酸只有精氨酸；②雙魚精蛋白，堿性氨基酸含有精氨酸和組氨酸與賴氨酸其中的1 種；③三魚精蛋白，含有精氨酸、組氨酸和賴氨酸3 種堿性氨基酸[5]。

大多數(shù)魚精蛋白不是單一組成，而是由多種性質(zhì)相近的蛋白共同組成的混合物，不同魚種的魚精蛋白的堿性氨基酸占比不同。

不同魚精蛋白的堿性氨基酸占比見表1。

表1 不同魚精蛋白的堿性氨基酸占比

由表1 可知，金槍魚、鰱魚、鯉魚、魷魚及大馬哈魚為三魚精蛋白；鲀魚精蛋白為雙魚精蛋白；鯡魚、烏魚、鮭魚精蛋白為單魚精蛋白，其中精氨酸為主要堿性氨基酸，烏魚精蛋白精氨酸含量最高，達到了88.39%。

2 魚精蛋白的制備與檢測

2.1 魚精蛋白的制備

1870 年，瑞士科學(xué)家首次從萊茵河鮭魚精巢中得到一種含氯化合物，將其命名為“魚精蛋白”。之后，德國、前蘇聯(lián)、美國科學(xué)家分別從不同魚種中提取出魚精蛋白。早期主要采用硫酸或鹽酸提取，大量有機溶劑洗滌沉淀的方法提取魚精蛋白。其中，硫酸提取法以其操作簡便、成本較低的優(yōu)點成為了魚精蛋白粗提取的主要方法[8]。張家源[11]采用硫酸提取，冷乙醇沉淀的方法從鲀魚魚白中成功提取出魚精蛋白，并驗證其具有良好的抑菌活性。鐘立人、曹文紅等人[13-14]也采用硫酸提取結(jié)合試劑沉淀的方法，分別從鯉魚、中巨石斑魚魚白中提取出具有活性的魚精蛋白。

工業(yè)化生產(chǎn)中為了進一步降低生產(chǎn)的成本，擴大生產(chǎn)規(guī)模，通常采用超聲輔助、生物酶輔助、吸附劑及膜萃取的方式提取魚精蛋白，經(jīng)加工的魚精蛋白可應(yīng)用于科研、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域[15-18]。

2.2 魚精蛋白的純化與鑒定

經(jīng)酸提法初步提取出的魚精蛋白通常含有其他雜蛋白，若要得到純度較高的魚精蛋白還需進一步純化。粗魚精蛋白的純化通常采用葡萄糖凝膠過濾層析（Gel filtration chromatography，GFC）、離子交換層析（Ion-exchange chromatography, IEC） 及等電點沉淀等方法（見表2）。純化后可采用反相高效液相色譜（Reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE） 及LC-MS 的方法進行魚精蛋白的定性鑒定[19-20]。

表2 魚精蛋白的純化方法

上官新晨[8]通過等電點沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析三步法純化鯉魚精蛋白，經(jīng)高效液相色譜以及凝膠電泳鑒定顯示單一峰和單一條帶，得到了純度較高的鯉魚精蛋白。最新的研究顯示，魷魚[9]、鲀魚[11]等魚的精蛋白經(jīng)凝膠過濾層析、離子交換層析的方法純化后，仍存在多種不同分子量的組分，表明魚精蛋白的非單一蛋白的特性。

魚精蛋白的純化方法見表2。

2.3 魚精蛋白的定量檢測

魚精蛋白作為肝素的拮抗劑已被廣泛應(yīng)用于臨床，對血液中的肝素和魚精蛋白需要精準快速定量，才能準確應(yīng)用于臨床醫(yī)療中，規(guī)避可能存在的風險。目前，魚精蛋白檢測的主要方法有高效液相色譜法、常規(guī)比色法、傳統(tǒng)熒光法和電化學(xué)分析等方法，然而這些方法具有一些缺點，如復(fù)雜的儀器和繁瑣的程序，液相色譜法目前普遍用于定性檢測，傳統(tǒng)熒光法雖然靈敏，但難以避免干擾物質(zhì)[22-23]。表3 為魚精蛋白最新定量檢測方法，新型熒光法在魚精蛋白的檢測中具有操作簡便、高靈敏度等優(yōu)勢，成為了研究的熱點。

表3 魚精蛋白的檢測方法

魚精蛋白的檢測方法見表3。

3 魚精蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

3.1 結(jié)構(gòu)

不同來源的魚精蛋白一級結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，如N 端富含親水的氨基酸殘基、精氨酸、賴氨酸等，C 端大多具有疏水性殘基；魚精蛋白均含有多個精氨酸簇，且被特定的氨基酸殘基（如Ser，Thr，Gly-Gly 等） 分隔開。有研究者對于魚精蛋白的抑菌機理進行研究，得出精氨酸可產(chǎn)生靜電作用，破壞細菌的細胞壁結(jié)構(gòu)[34]。目前，普遍認為是精氨酸與細菌細胞壁上的肽聚糖產(chǎn)生靜電作用，從而抑制細菌生長[35]。精氨酸的含量與魚精蛋白的抑菌效果是否存在對應(yīng)關(guān)系，還有待進一步探究。另有研究顯示，通過修飾魚精蛋白的氨基酸殘基側(cè)鏈，可增強魚精蛋白的抑菌能力[36]，說明魚精蛋白的抑菌活性和一級結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，未來可通過改變魚精蛋白的序列來增強其生物活性。

魚精蛋白也可以稱作抗菌肽，以二級結(jié)構(gòu)分類，天然抗菌肽可分為α - 螺旋肽、β - 折疊肽、線性延伸肽和環(huán)狀肽[37]。Roque A 等人[38]研究了鮭精蛋白及魷魚精蛋白的結(jié)構(gòu)，二者具有相似數(shù)量的β - 轉(zhuǎn)角，但α - 螺旋和非氫鍵結(jié)構(gòu)比例差異巨大。皮杜鵑[39]則首次研究了魚精蛋白二級結(jié)構(gòu)和抑菌活性的關(guān)系，認為隨著β - 轉(zhuǎn)角含量降低，抑菌活性也相對降低。已有的研究存在許多明顯的不足之處，結(jié)構(gòu)的研究不夠深入廣泛，并未闡明高級結(jié)構(gòu)的變化與功能之間的關(guān)系，結(jié)構(gòu)與抗凝血活性的關(guān)系也有待闡明。解析魚精蛋白的結(jié)構(gòu)對于了解魚精蛋白的作用機理至關(guān)重要，能夠為魚精蛋白的生物合成及修飾提供方向。

3.2 魚精蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

1931 年，Uyttendaele M等人[40]首次報道了魚精蛋白的抑菌活性，因其來源于食物，具有純天然、無毒性的特點，成為綠色食品防腐劑的首選。魚精蛋白的抑菌機理主要有3 種觀點：①破壞菌體細胞壁或細胞膜結(jié)構(gòu)；②作用于細胞內(nèi)部的核酸和蛋白質(zhì)；③抑制菌體內(nèi)能量相關(guān)酶的活性[41]。

20 世紀，日本就將魚精蛋白作為防腐劑用于飯團、乳油等食品中[12]。李兆龍[42]報道，將牛奶、雞蛋等食品中添加0.5%～1.0%魚精蛋白可將保質(zhì)期提升至5～6 d，滿足人們對天然無化學(xué)添加的高品質(zhì)的需求。

魚精蛋白也可與其他防腐劑結(jié)合使用，減少化學(xué)防腐劑的使用量，降低潛在食品安全隱患。王陸玲等人[43]用魚精蛋白與山梨酸鉀復(fù)配，結(jié)果表明二者復(fù)配優(yōu)于單獨使用，且在1%的質(zhì)量分數(shù)下即具有良好防腐功能。魚精蛋白可以與醋酸、甘氨酸、苯甲酸鈉等化學(xué)防腐劑復(fù)配[12]，也可以與其他天然防腐劑，如迷迭香、香芹酚等復(fù)配，均能夠延長食品的保質(zhì)期[44-46]。

最新研究顯示，具有抗氧化、抗疲勞活性的魚精蛋白肽均已成功制備，其應(yīng)用于功能食品的潛力巨大[47-50]。

魚精蛋白應(yīng)用于食品領(lǐng)域仍存在諸多問題，如產(chǎn)量不足、成本過高等。目前，通過基因工程表達和人工合成具有活性的魚精蛋白已有文章報道，從傳統(tǒng)的提取純化加工轉(zhuǎn)化為基因工程生產(chǎn)可顯著降低成本，仍需進一步研究[51]。

3.3 醫(yī)學(xué)中的功能

魚精蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更為深入。①肝素拮抗功能。魚精蛋白硫酸鹽是體外循環(huán)心臟手術(shù)中唯一對抗肝素的藥物，可作抗凝血劑的解毒劑[52]。其作用機理是魚精蛋白可與肝素形成復(fù)合物，使肝素失活[53]。魚精蛋白也可能引起不良反應(yīng)，最新的研究表明，不同給藥劑量和給藥方式，可能避免此類風險。使用腎上腺素、多巴胺等，治療不良反應(yīng)的出現(xiàn)[54-57]。②緩釋胰島素功能。魚精蛋白能夠與多和胰島素結(jié)合，阻止或延遲胰島素釋放，進而延長胰島素的作用時間，且未見明顯不良反應(yīng)，具有低風險的特性。目前，魚精蛋白重組胰島素已被應(yīng)用于臨床治療[58]。③抗腫瘤功能。研究證明，魚精蛋白可抑制腫瘤細胞分泌出的腫瘤蛋白，進而抑制結(jié)直腸癌細胞分裂增殖，具有臨床抗癌的效果。④調(diào)節(jié)免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，魚精蛋白能夠誘導(dǎo)體液免疫，增強小鼠對大腸桿菌的抵抗力，可作為大腸桿菌疫苗的候選佐劑，具備高度潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值，可進一步研究魚精蛋白的促進免疫特性，為后續(xù)魚精蛋白應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。除此之外，魚精蛋白還可以治療男性不孕不育，以及作為非病毒載體應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

4 結(jié)語

魚精蛋白具有多種獨特的生物功能，有待充分的研究，實現(xiàn)魚白的精深加工和利用，未來研究將聚焦于以下幾個方面。①優(yōu)化魚精蛋白的提取純化方法，降低成本，從而獲得高純度的蛋白，成為安全的醫(yī)學(xué)材料；②通過質(zhì)譜技術(shù)、X射線衍射技術(shù)和生物信息學(xué)分析、功能評價等，對于魚精蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行深入的探討，以明確魚精蛋白的功能機理；③探究魚精蛋白與更多防腐劑的復(fù)配保鮮作用，更好地發(fā)揮其綠色防腐功效；④采用基因工程的手段生產(chǎn)和改造魚精蛋白，實現(xiàn)從天然提取到生物制造、生物改造等現(xiàn)代加工方式。

隨著研究的不斷深入，魚精蛋白將成為水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)鏈上的重要一環(huán)，被更廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)等更多領(lǐng)域中，為人類作出更多貢獻。