黃花倒水蓮的組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究

蔡梅玲 饒衛(wèi)芳 羅萬(wàn)周 張鳳 范秀瓊 朱昔嬌

摘 要：本文主要研究黃花倒水蓮的組織培養(yǎng)與快速繁殖，就組織培養(yǎng)，分別從胚軸、葉片、莖段入手開(kāi)展分析，對(duì)比不同調(diào)節(jié)劑對(duì)不同外植體不定芽誘導(dǎo)的影響，同時(shí)闡述光照、有機(jī)添加物對(duì)不定芽生長(zhǎng)與繁殖的影響。成功誘導(dǎo)出黃花倒水蓮愈傷組織，能夠在一定程度上加深生成代謝產(chǎn)物提取等方面的研究，讓其擁有一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文分別從不同角度研究黃花倒水蓮組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)，旨在為解決稀缺藥用植物繁殖問(wèn)題提供參考性意見(jiàn)。

關(guān)鍵詞：黃花倒水蓮;組織培養(yǎng);快速繁殖

隨著人類對(duì)藥用植物需求量的不斷增加，野生藥用植物資源，雖說(shuō)具備較高的藥用價(jià)值，但資源產(chǎn)生速度緩慢，難以滿足市場(chǎng)發(fā)展。稀缺藥用植物資源保護(hù)，借助組織培養(yǎng)離體快速繁殖技術(shù)，能夠有效保存大量的稀缺資源，進(jìn)一步解決了市場(chǎng)對(duì)資源的需求量。本文研究先將黃花倒水蓮的葉片、胚軸、莖段的三種材料視作培養(yǎng)組織，從兩種途徑入手，構(gòu)建黃花倒水蓮再生體系。旨在為解決稀缺藥用植物繁殖問(wèn)題提供參考性意見(jiàn)。

一、黃花倒水蓮的相關(guān)概述

黃花倒水蓮又被稱之為Polygala fallax，其屬于小喬木種類，主要分布在我國(guó)的湖南、廣西、云南等南方地區(qū)。黃花倒水蓮具有較高的藥用價(jià)值，所以在早期就被人們認(rèn)識(shí)，具有較大的市場(chǎng)需求量，由于黃花倒水蓮資源一般都是野生，這類野生資源不能大規(guī)模生產(chǎn)，因此十分有限，而巨大的市場(chǎng)需求量導(dǎo)致出現(xiàn)了嚴(yán)重的過(guò)渡采集情況，導(dǎo)致黃花倒水蓮資源嚴(yán)重短缺。本文主要利用了組織培養(yǎng)離體快繁技術(shù)研究了黃花倒水蓮的胚軸、莖段以及葉片等三個(gè)不同的外植體，站在多方面和多途徑的角度上構(gòu)建出了更加完善的黃花倒水蓮離體快繁的再生體系，在一定程度上解決了目前黃花倒水蓮資源短缺的問(wèn)題。

二、實(shí)驗(yàn)使用的材料與實(shí)驗(yàn)方式

1.實(shí)驗(yàn)采用的材料及條件

以黃花倒水蓮的成熟種子作為研究材料，黃花倒水蓮種子采自2016年廣東省梅州市梅南林場(chǎng)，將所有的成熟種子使用自來(lái)水清洗干凈，并用干凈紙將水漬全部擦干。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的酒精進(jìn)行擦拭，一般擦拭的時(shí)間為30s，然后將其放入升汞溶液當(dāng)中進(jìn)行消毒，并使用無(wú)菌水對(duì)其沖洗，再使用無(wú)菌濾紙將其水分吸干，使用小刀在無(wú)菌的操作臺(tái)上去掉種子的外種皮，將其放入單位為MS+BAP 1.0 μmol·L-1的培養(yǎng)基中， 將其放入培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)室的環(huán)境溫度應(yīng)為25℃，大概7d之后種子就會(huì)開(kāi)始萌發(fā)，當(dāng)種子萌發(fā)20d左右時(shí)，將幼苗中的胚軸取出培養(yǎng)在外界環(huán)境當(dāng)中，30d后再去幼苗的莖段和葉片為外植體。

培養(yǎng)基的主要成分包括維生素和MS的無(wú)機(jī)鹽等，并且還需要保證pH值為6。

2.實(shí)驗(yàn)的具體方式

（1） 胚軸外植體誘導(dǎo)不定芽發(fā)生分析。該實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的外植體為20d大的油壓胚軸，接BAP 2.0+NAA 0.2，TDZ 2.0+NAA 0.2，BAP 5.0+NAA 0.2，TDZ 5.0+NAA 0.2，KT 2.0+NAA 0.2，BAP 2.0+IBA 0.2TDZ 2.0+IBA 0.2，等濃度不同且具有組合激素的培養(yǎng)基當(dāng)中，一般需要培養(yǎng)30d，然后對(duì)其結(jié)果進(jìn)行觀察，并將不定芽的誘導(dǎo)率記錄下來(lái)，計(jì)算出不定芽的平均數(shù)以及不定芽的實(shí)際生產(chǎn)情況。

（2）莖段外植體誘導(dǎo)叢芽發(fā)生分析。該分析中的外植體為1個(gè)月大的黃花倒水蓮無(wú)菌試管苗莖段， 將其切成大小相同的莖段，并接入濃度不同且具有組合植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中（如下表所示）。一共有4瓶，每瓶中會(huì)對(duì)20個(gè)處理體進(jìn)行處理，一般情況下需要對(duì)其重復(fù)處理三次，放置30d后對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察，并將不定芽的誘導(dǎo)率、繁殖系數(shù)以及不定芽的生長(zhǎng)情況記錄下來(lái)。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?如表1便是黃花倒水蓮莖段誘導(dǎo)不定芽發(fā)生具體情況。

（3）葉片外植誘導(dǎo)愈傷組織及形成分析。將種苗的葉片分別放入8種濃度不同且組合激素也不同的培養(yǎng)基種，在每個(gè)處理器種含有20個(gè)外植體，需要對(duì)每個(gè)外植體重復(fù)處理三次，培養(yǎng)30d后需要對(duì)愈傷誘導(dǎo)率進(jìn)行計(jì)算，并將質(zhì)量較好的愈傷轉(zhuǎn)接到特定的培養(yǎng)基當(dāng)中，從而誘導(dǎo)不定芽發(fā)生。如表2便是黃花倒水蓮葉片誘導(dǎo)愈傷具體情況。

（4）不同光照有機(jī)物添加劑影響效果?；九囵B(yǎng)基的規(guī)格為MS+BAP 2.0+NAA 0.2，其中外植體為3cm的黃花倒水蓮莖段，將莖段分別放入光照不同的培養(yǎng)室種進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)置MS對(duì)照，每個(gè)培養(yǎng)基種對(duì)20個(gè)外植體進(jìn)行處理，每個(gè)外植體需要重復(fù)處理3次，對(duì)其培養(yǎng)30d之后對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察，并將莖段增值的系數(shù)以及外植體莖段的平均長(zhǎng)度等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

將MS作為基本培養(yǎng)基，其中外植體為3-4cm的莖段，將這些莖段轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基當(dāng)中，30d后對(duì)生根率以及根系的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。清理干凈生根的小苗基部之后將其移至遮蔭的溫室中的混合基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)混合基質(zhì)中培養(yǎng)100株的小苗，30d后對(duì)移栽成活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3.相關(guān)數(shù)據(jù)分析

本文研究中所用的所有數(shù)據(jù)是由專業(yè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，通過(guò)對(duì)組間的數(shù)據(jù)關(guān)系進(jìn)行對(duì)比，得到相應(yīng)的分析結(jié)果，組間數(shù)據(jù)比較使用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料為[n（）]，組間數(shù)據(jù)比較使用t檢驗(yàn)，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)界定，分析組間數(shù)據(jù)差異及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.胚軸外植體誘導(dǎo)不定芽發(fā)生結(jié)果

以胚軸作為外植體，將其放置在BAP調(diào)節(jié)劑MS培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)15d，外植體的開(kāi)始增大，隨之形成多個(gè)凸起部位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MS+BAP 2.0+NAA 0.2能夠加速胚軸誘導(dǎo)不定芽的發(fā)生，誘導(dǎo)率為100.0%，平均不定芽數(shù)量為12.3個(gè)。當(dāng)其中BAP的濃度增加到5.0，不定芽的誘導(dǎo)率下降，大幅度減少了不定芽的數(shù)量，并且不定芽中會(huì)分化出一些無(wú)用的愈傷。整個(gè)芽苗的生長(zhǎng)趨勢(shì)相對(duì)較差，并且一部分芽苗還出現(xiàn)了水漬的情況。在擁有調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中放入胚軸進(jìn)行誘導(dǎo)生產(chǎn)的不定芽的生長(zhǎng)狀況較差，而且芽苗的基部出現(xiàn)了白色的疏松愈傷問(wèn)題。