從DNA 甲基化探討鈣化性主動脈瓣膜疾病的發(fā)病機制

羅瑋、劉超綜述，叢洪良審校

隨著我國風濕熱發(fā)病率逐年下降，鈣化性主動脈瓣膜?。–AVD）成為老年人最常見的心臟瓣膜病，且隨著人們生活方式、人口老齡化、科學技術(shù)和健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展而呈現(xiàn)出逐年增長的趨勢。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CAVD 是涉及內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)浸潤、慢性炎癥、基質(zhì)重構(gòu)、細胞分化、鈣鹽沉積及新生血管形成等復雜變化的主動過程，對CAVD 發(fā)病機制的研究有可能使藥物治療延緩或逆轉(zhuǎn)CAVD 的發(fā)展成為可能。

1 CAVD 發(fā)病機制

主動脈瓣葉分三層，各層由瓣膜間質(zhì)細胞（VIC）、細胞外基質(zhì)（ECM）以及瓣膜內(nèi)皮細胞（VEC）組成，沒有血管組織。Venardos 等[1]發(fā)現(xiàn)應用Toll樣受體4（TLR-4）分別對培養(yǎng)的正常主動脈瓣、二尖瓣、肺動脈瓣和三尖瓣VIC 進行促炎性刺激，結(jié)果顯示只有主動脈瓣VIC 受刺激后發(fā)生成骨樣分化，其余瓣膜VIC 不發(fā)生成骨分化，提示主動脈瓣VIC成骨分化可能是CAVD 發(fā)病的重要基礎(chǔ)，而對VIC的調(diào)控很大程度上是通過瓣膜內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞傳遞的[2]。

1.1 內(nèi)皮損傷與慢性炎癥

內(nèi)皮細胞層遭到破壞之后，淋巴細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤，瓣膜內(nèi)氧化低密度脂蛋白積累，炎癥信號通路激活，VIC 增生活化是引起瓣膜鈣化的重要起點。Wang 等[3]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞激活后釋放的炎性因子高遷移率族蛋白1（HMGB1），可以引起更多的促炎因子的釋放，同時磷酸化激活c-Jun 氨基末端激酶-絲裂原活化激酶（JNK-MAPK）信號系統(tǒng)，而抑制JNK-MAPK 信號系統(tǒng)磷酸化可以阻滯VIC 的成骨表型轉(zhuǎn)化及礦化，從而得出結(jié)論，HMGB1 通過TLR4-JNK-核轉(zhuǎn)錄因子κ B（NF-κB）途徑促進CAVD 的進展。

1.2 細胞表型轉(zhuǎn)化及異位鈣化

剪切應力、機械變形、ECM 重塑和炎癥刺激引起內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（EndMT），有研究通過將氨基葡聚糖硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等加入到3D膠原水凝膠中對微環(huán)境的變化進行模擬，觀察其對EndMT 的影響，發(fā)現(xiàn)高水平的氨基葡聚糖硫酸軟骨素誘導了最高的EndMT 轉(zhuǎn)化率，并通過間質(zhì)轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生了最多的膠原蛋白，這表明細胞表型最有可能促進纖維性疾病[4]。發(fā)生EndMT 的細胞同時表達內(nèi)皮細胞標記物CD31，又稱為血小板-內(nèi)皮細胞粘附分子（PECAM-1/CD31）和間質(zhì)細胞標記物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）。在鈣化性主動脈瓣疾病中，VEC 通過EndMT 修補受傷的成人瓣葉并在此過程中進行成骨分化，VEC 經(jīng)由轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）介導發(fā)生EndMT 后測定其α-SMA、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）的信使mRNA 表達顯著增強，并且這一過程可以被VIC 抑制[5]。

升高的低密度脂蛋白與動脈粥樣硬化（AS）及CAVD 的關(guān)系已被證實，動物研究表明脂質(zhì)通過激活細胞信號通路Wnt /低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（LRP5）發(fā)揮重要的作用[6]，在瓣膜發(fā)育成熟后，升高的低密度脂蛋白通過與LRP5/6 結(jié)合，進而引起瓣膜細胞增殖分化發(fā)生成骨反應，最終導致CAVD[7]。

1.3 骨代謝異常

鈣化的主動脈瓣中，會出現(xiàn)異位骨化，骨保護蛋白細胞因子系統(tǒng)即骨保護素（OPG）/NF—κB受體活化因子配基（RANKL）/RANK 系統(tǒng)參與了這一過程。對60 例主動脈瓣狹窄的患者，留取其置換的瓣膜組織，根據(jù)鈣化程度分為鈣化組和非鈣化組，通過測定兩組間血清OPG、RANKL、骨鈣素、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素-1（IL-1）和IL-6 的水平，發(fā)現(xiàn)瓣膜鈣化的患者OPG（P=0.0006）和TNFα（P=0.02）水平較低，且較少患糖尿病（P=0.04），其瓣膜顯示出較高的骨化發(fā)生率（P=0.002）及降低的脂質(zhì)積累（P=0.04）。在多元分析中，血循環(huán)中低OPG 水平和未患糖尿病是瓣膜鈣化的預測因子[8]。由于CAVD 的發(fā)病機制與動脈粥樣硬化基本一致，但是有大約50%的CAVD 患者并不伴隨有明顯的動脈粥樣硬化，F(xiàn)ojt 等[9]進行實驗，測量鈣化狹窄的主動脈瓣組織的OPG 水平并研究其與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性。實驗從105 位CAVD 的患者中收集主動脈瓣樣本，并根據(jù)冠狀動脈是否存在50%以上狹窄將其分為：A 組冠狀動脈正常組，B 組冠狀動脈狹窄組，并入選即無主動脈瓣狹窄也無冠狀動脈狹窄的患者設(shè)為C 組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A 組瓣膜組織中OPG 水平最高，B 組和C組的瓣膜組織中OPG 水平?jīng)]有顯著性差異，這與之前所進行的實驗發(fā)現(xiàn)B 組循環(huán)血中OPG 水平最高有所不同，提示循環(huán)血中OPG 濃度的增高抑制了局部瓣膜組織OPG 的生成，而局部組織中的高OPG 濃度抑制了破骨細胞的活性，加重了瓣膜鈣化的進展。

2 DNA 甲基化與鈣化性主動脈瓣膜病

DNA 甲基化是指以s-腺苷甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，經(jīng)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的調(diào)節(jié)，將供體的甲基轉(zhuǎn)移到5’端Cp G 二核苷酸的胞嘧啶上，使之變?yōu)?-甲基胞嘧啶。基因的表達程度與Cp G 島甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，高表達基因趨向于低甲基化狀態(tài)，而沉默基因則呈高甲基化狀態(tài)，即DNA 甲基化與基因表達水平呈負相關(guān)，異常的DNA甲基化模式是許多疾病共同的分子學基礎(chǔ)。

2.1 DNA 甲基化與心血管疾病

心血管疾病中普遍存在著DNA 甲基化修飾， AS及鈣化過程中相關(guān)基因的DNA 甲基化異常是最近的研究熱點之一。MMPs 能特異性與細胞外基質(zhì)成分相結(jié)合并降解細胞外基質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌梗死以及頸動脈狹窄患者中，血漿MMP-2 濃度升高[10]。Chen 等[11]發(fā)現(xiàn)，微小RNA-29b（microRNA-29b，miRNA-29b）通過抑制DNA甲基化關(guān)鍵酶DNMT3b 的表達，間接降低MMP-2/MMP-9 基因的甲基化水平，促進了MMP-2/MMP-9的表達，從而極大地促進了人主動脈平滑肌細胞（HASMC）細胞的遷移，MMP-2、MMP-9 基因低甲基化可能是動脈粥樣硬化的一種潛在機制。

終末期腎?。‥SRD）患者血管鈣化發(fā)生率高，最新研究證實ESRD 患者普遍存在血管鈣化和血管局部Klotho 基因超甲基化，Chen 等[12]采用硫酸吲哚酚聯(lián)合5/6 腎切除建立尿毒癥大鼠血管鈣化模型，并通過茜素紅鈣鹽沉積染色觀察了硫酸吲哚酚組胸主動脈的血管鈣化程度，采用免疫組織化學染色和Westen Blot 觀察了胸主動脈血管平滑肌細胞表型標志物α-SMA 和成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)基因骨橋蛋白的表達水平后得出結(jié)論，硫酸吲哚酚通過上調(diào)血管平滑肌細胞DNMT1 及DNMT3a 的表達，啟動Klotho 基因超甲基化，進而下調(diào)Klotho 基因轉(zhuǎn)錄和表達，誘導血管平滑肌細胞成骨轉(zhuǎn)化和血管鈣化。

在9p21 染色體附近的細胞依賴性激酶抑制劑2a/2b（CDKN 2a/2b）與動脈粥樣硬化和動脈鈣化有關(guān)，而CDKN2a/2b 是一個經(jīng)常被報道的DNA 甲基化位點，Zhou 等[13]等測量322 位缺血性卒中患者的外周血白細胞中CDKN 2a/2b 的DNA 甲基化水平，發(fā)現(xiàn)CDKN2b 的甲基化水平與頸動脈鈣化分數(shù)的立方根（β=0.591±0.172，P=0.001）呈正相關(guān)，提示CDKN2b的DNA甲基化可能在動脈鈣化中發(fā)揮作用。

2.2 DNA 甲基化與主動脈瓣鈣化

CAVD 是長期發(fā)展的慢性過程，由于累及的組織器官均己分化成熟，所以基因和染色體的修飾如DNA 甲基化、組蛋白的乙?；缺碛^遺傳學調(diào)控機制可能起主要的作用，并且與動脈粥樣硬化相似的發(fā)病機制也為此推測提供可能性并在近期的研究中得到證實。

Nagy 等[14]比較了正常和鈣化的人主動脈瓣組織發(fā)現(xiàn)，鈣化的組織在促炎酶5-脂氧基酶（5-LOX）基因編碼的啟動子中DNA 甲基化減低，同時5-LOX mRNA 水平升高。用DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2dC）作用于培養(yǎng)的VIC，也發(fā)現(xiàn)5-LOX mRNA 的水平升高和白三烯的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)提供了在瓣膜性心臟病中對VIC 的表觀遺傳修飾的一個證據(jù)。主動脈瓣的成骨活性是在Notch1 的控制下進行的，它調(diào)節(jié)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）和骨形成蛋白-2（BMP-2）等基因表達的改變。研究發(fā)現(xiàn)在鈣化性主動脈瓣疾病中長鏈非編碼RNA（lncRNA） H19 的表達增加，而其啟動子區(qū)域的甲基化程度與H19 的表達成反比，H19 通過改變Notch1 途徑誘發(fā)VIC 成骨表型的轉(zhuǎn)化。在H19缺失的VIC 中，NOTCH1 的表達增強，而RUNX2和BMP-2 的水平降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，在CAVD 中，H19 的啟動子中DNA 甲基化的失調(diào)，與lncRNA 的表達有關(guān)，后者通過干擾Notch1 的表達來促進成骨細胞的轉(zhuǎn)化[15]。

現(xiàn)已證實，參與骨鈣化的信號通路如Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路、OPG/RANKL/RANK信號通路也同樣對主動脈瓣鈣化進行調(diào)節(jié)[16-17]，并且Wnt/β-catenin 信號通路、OPG/RANKL/RANK 信號通路均發(fā)現(xiàn)存在DNA 甲基化修飾的證據(jù)。

Wnt 與跨膜受體家族（FZD）及LRP5/6 結(jié)合為共受體后，Wnt 信號通路激活,使β-catenin 穩(wěn)定，穩(wěn)定的β-catenin 轉(zhuǎn)入細胞核，與淋巴增強子結(jié)合因子（LEF）及T 細胞因子（TCF） 結(jié)合,激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進成骨細胞分化增生[18]。因此Wnt通路某些基因表達受到調(diào)控，即能調(diào)控成骨細胞的增生、分化，影響骨轉(zhuǎn)換。在骨質(zhì)疏松的過程中，間葉細胞（MSC）向脂肪細胞的轉(zhuǎn)化會導致骨質(zhì)量和脂肪的不平衡，從而增加骨折的風險。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者的MSC 中增強子（EZH2）的表達明顯增加，EZH2 直接增加了Wnt1、Wnt6 和Wnt10a 的啟動子的甲基化水平，從而抑制Wnt 基因轉(zhuǎn)錄，對Wnt/β-catenin 信號通路的抑制，促進了MSC 向脂肪細胞的轉(zhuǎn)化。通過使用EZH2 抑制劑，在體外促進了成骨細胞分化，在患骨質(zhì)疏松的小鼠體內(nèi)成功地增加了骨形成，抑制了過量的骨髓脂肪的形成[19]。

OPG 與RANK 特異性結(jié)合，抑制破骨細胞前體細胞的分化和成熟破骨細胞的骨吸收，并誘導破骨細胞凋亡，從而抑制破骨細胞介導的骨吸收。RANK 與RANKL 特異性結(jié)合可刺激破骨細胞前體細胞分化，活化成熟破骨細胞，阻止破骨細胞凋亡并延長其壽命，促進骨吸收[20]。Delgado-calle 等[21]在人的骨組織上發(fā)現(xiàn)存在RANKL 和OPG 基因甲基化的現(xiàn)象，并證實5-Aza-dC 可以降低RANKL和OPG 基因甲基化，使RANKL 和OPG 表達增加。Nishikawa 等[22]發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a 能夠通過偶聯(lián)SAM 介導的代謝途徑，抑制抗破骨細胞形成基因的表達，調(diào)節(jié)破骨細胞分化，該代謝過程涉及RANKL 通路相關(guān)基因甲基化的改變。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）在破骨細胞分化過程中表達增強，抑制PRMT5 通過甲基化調(diào)節(jié)，降低趨化因子C-X-C 基配體10（CXCL10）及抗病毒蛋白RSAD2 的表達，從而導致RANKL 的抑制并最終抑制破骨細胞分化，防止卵巢切除術(shù)后的骨丟失[23]。

由于CAVD 晚期的發(fā)病機制與骨形成類似，因此是否可以推測，DNA 甲基化修飾同樣參與了主動脈瓣膜的主動異位鈣化過程。

綜上所述，CAVD 是復雜的多因素參與的主動調(diào)節(jié)過程，其發(fā)病機制包含內(nèi)皮損傷、炎性細胞浸潤、細胞表型轉(zhuǎn)化及異位鈣化等復雜改變，涉及BMP2/Smads/RUNX2、Notch、Wnt/β-catenin、NF-κB 和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶-1（ERK1）/ERK2及OPG/RANKL/RANK等多信號通路[24-25]。盡管如此，作為一種遺傳因素與環(huán)境因素相互作用，涉及復雜細胞分子學機制的慢性進展性疾病，其確切的發(fā)病機制尚不明確。對CAVD 發(fā)病機制及其信號通路中相關(guān)基因的甲基化修飾研究，為從分子學水平研究CAVD 的發(fā)病機制提供了新途徑，從而對疾病的預防及治療提供更有效的手段。