HPLC測(cè)定長柄扁桃仁及餅粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷

郭咪咪，朱琳，段章群，張東，李秀娟，李曉寧

（國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

苦杏仁苷（amygdalin）是一種糖苷化合物，主要存在于杏、桃、蘋果、李子、山楂等植物的種仁中，被苦杏仁酶、櫻葉酶等β-葡萄糖甙酶水解，依次生成野黑櫻苷（prunasin）和杏仁腈（mandelonitrile），杏仁腈再分解生成苯甲醛和氫氰酸（HCN）[1]。少量的氫氰酸能夠起到鎮(zhèn)咳平喘功效，但在人體內(nèi)積累一定量后會(huì)抑制酶活性，進(jìn)而抑制組織細(xì)胞呼吸，導(dǎo)致死亡[2]。氫氰酸對(duì)人的急性致死量為0.5～3.5 mg/kg體重，在食用木薯淀粉衛(wèi)生指標(biāo)和飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中均有其限量要求，而目前氫氰酸的含量主要是通過測(cè)得的苦杏仁苷質(zhì)量換算而得到。因此，長柄扁桃仁或餅粕作為食品、藥品或飼料時(shí)，必須嚴(yán)格控制苦杏仁苷含量，進(jìn)而減少有害降解產(chǎn)物氫氰酸的安全風(fēng)險(xiǎn)。目前苦杏仁苷含量測(cè)定方法國內(nèi)外已有文獻(xiàn)[3～6]報(bào)道，但在苦杏仁苷與降解物、液相法同時(shí)測(cè)定苦杏仁苷和中間產(chǎn)物野黑櫻苷含量等方面的報(bào)道研究較少，本文旨在建立一種高效準(zhǔn)確的苦杏仁苷與野黑櫻苷的高效液相色譜測(cè)定方法。

本文基于2010年版中國藥典一部及相關(guān)文獻(xiàn)[7,8]，優(yōu)化高效液相色譜測(cè)定長柄扁桃仁與餅粕中苦杏仁苷及其降解產(chǎn)物-野黑櫻苷的方法，同時(shí)對(duì)長柄扁桃仁與餅粕中苦杏仁苷和野黑櫻苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定長柄扁桃仁、餅粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷的含量，進(jìn)而達(dá)到明確有害降解產(chǎn)物氫氰酸含量的目的。與相關(guān)研究相比，本方法的含量測(cè)定范圍中包含了飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中HCN的限量值，而且能夠同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)苦杏苷與中間降解產(chǎn)物野黑櫻苷含量，為高效液相色譜測(cè)定長柄扁桃仁及其系列產(chǎn)品中苦杏仁苷與野黑櫻苷提供依據(jù)，為長柄扁桃仁系列產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

長柄扁桃仁樣品采自我國陜西省神木。

甲醇、乙腈、純水為色譜級(jí)，石油醚為分析純，苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品（≥96%），Sigma公司，野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)品（≥95%），Sigma公司等。

中草藥粉碎機(jī)jx-600，天津市泰斯特儀器有限公司；分析天平（0.0001 g）、數(shù)控超聲波清洗器KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)TU-1810，北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀（配置紫外檢測(cè)器）1100，Agilent公司；低速大容量多管離心機(jī)、漩渦振蕩器、慢速定量濾紙等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦杏仁苷、野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取12.5 mg苦杏仁苷與5.0 mg野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，分別定溶于25 mL、10 mL容量瓶中，即分別得到質(zhì)量濃度均為500 μg/mL的苦杏仁苷與野黑櫻苷甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩７謩e吸取2 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至不同10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得100 μg/mL苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μg/mL野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Aglient ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相為20%甲醇和80%水，流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長為210 nm；柱溫為30 ℃。

1.2.3 樣品前處理

長柄扁桃仁系列產(chǎn)品包括長柄扁桃仁、長柄扁桃油和長柄扁桃餅、粕。液壓制備長柄扁桃油得到的長柄扁桃餅，當(dāng)含油量≥8%時(shí)采取1.2.3.1樣品處理方法，而含油量＜8%時(shí)采取1.2.3.2樣品處理方法。長柄扁桃油在所研究樣品中未檢測(cè)到苦杏仁苷和野黑櫻苷，所以本研究以長柄扁桃仁和餅、粕為主。

1.2.3.1 長柄扁桃仁樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.20 g經(jīng)粉碎機(jī)粉碎的長柄扁桃仁或長柄扁桃餅（含油量≥8%），置于50 mL已稱重的具塞離心管中，加入10 mL石油醚（30～60 ℃沸程），超聲10 min，4000 r/min離心10 min，棄去石油醚層，殘?jiān)貜?fù)提取兩次。待殘?jiān)腥軇┻^夜靜置揮干，稱重后按料液比1：200準(zhǔn)確加入甲醇，稱重，在功率為100%的超聲波作用下提取30 min，冷卻至室溫，稱重，甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，過濾，棄去前1 mL過濾液，收集續(xù)濾液。續(xù)濾液用20%甲醇稀釋5倍，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣。

1.2.3.2 長柄扁桃粕樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.10 g長柄扁桃粕或經(jīng)粉碎機(jī)粉碎的長柄扁桃餅（含油量＜8%），置于50 mL已稱重的具塞離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL甲醇，稱重，超聲（功率100%）提取30 min，冷卻至室溫，稱重，甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，過濾，棄去前1 mL過濾液，收集續(xù)濾液，續(xù)濾液用20%甲醇稀釋5倍，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

文中苦杏仁苷與野黑櫻苷的提取得率按公式（1）計(jì)算：

其中：c-從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到的待測(cè)液濃度，單位μg/mL；N-稀釋倍數(shù)；V-樣品提取液的體積，單位mL；m-稱樣質(zhì)量，單位g。

文中數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析與作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長

將苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液與 20%甲醇溶液混合，在190～400 nm波段下掃描。該溶液在210 nm波長附近有最大吸收，確定210 nm為苦杏仁苷的檢測(cè)波長。

圖1 乙腈水流動(dòng)相下苦杏仁苷色譜圖Fig.1 The amygdalin chromatograms under acetonitrile and water as flow phase

圖2 乙腈水甲醇流動(dòng)相下苦杏仁苷色譜圖Fig.2 The amygdalin chromatograms under acetonitrile,methanol and water as flow phase

圖3 甲醇水流動(dòng)相下苦杏仁苷色譜圖Fig.3 The amygdalin chromatograms under methanol and water as flow phase

圖4 甲醇水流動(dòng)相下野黑櫻苷色譜圖Fig.4 The prunasin chromatograms under methanol and water as flow phase

2.1.2 流動(dòng)相

比較了乙腈-水[9]、乙腈-水-甲醇[10～12]、甲醇-水[13,14]作為流動(dòng)相對(duì)苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜峰分離效果。結(jié)果表明，在流動(dòng)相為18%乙腈和82%水時(shí)，苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品可得到兩個(gè)相鄰色譜峰（圖1的5～10 min之間），且第一個(gè)色譜峰峰型較差；當(dāng)流動(dòng)相為2%乙腈、85%水和13%甲醇時(shí)，苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰（圖2）與18%乙腈和82%水作為流動(dòng)相時(shí)的相似；而當(dāng)流動(dòng)相為20%甲醇和80%水時(shí)，苦杏仁苷色譜峰（圖3約11 min處）為一個(gè)色譜峰，且分離較好，繼續(xù)此色譜條件檢測(cè)野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，均可得到不同于苦杏仁苷色譜峰位置的一個(gè)野黑櫻苷色譜峰（圖 4約 19 min處），同時(shí)，此色譜條件能夠達(dá)到兩標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰均有較好的峰型（符合峰型對(duì)稱性要求）和分離效果的目的。

2.2 苦杏仁苷提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑

苦杏仁苷的三水合物為斜方柱狀結(jié)晶（水），可溶于水、乙醇，幾乎不溶于乙醚。藥典[15]中選用甲醇、甲醇/水或乙醇/水溶液作為苦杏仁苷提取溶劑，寇凱等[10]研究得出甲醇提取苦杏仁苷，提取得率約為乙醇的5倍。本實(shí)驗(yàn)中研究了不同比例甲醇/水溶液（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇）對(duì)長柄扁桃粕中苦杏仁苷及其降解物的提取特性。結(jié)果表明，20%、40%甲醇提取液中未檢測(cè)到苦杏仁苷和野黑櫻苷（以20%甲醇提取液為例，如圖 5）。其它不同濃度甲醇/水提取液測(cè)定結(jié)果如圖6所示。

圖5 20%甲醇提取液色譜圖Fig.5 The chromatograms of 20% methanol extract

圖6可以看出，甲醇含量越高，苦杏仁苷提取得率越大，野黑櫻苷提取得率越小。當(dāng)甲醇含量≥90%時(shí)，提取溶液中幾乎檢測(cè)不到野黑櫻苷。說明水的存在可能對(duì)苦杏仁苷有分解作用，產(chǎn)生分解產(chǎn)物野黑櫻苷，所以研究選取甲醇作為提取溶劑，盡量避免降解原料中苦杏仁苷成分。同時(shí)對(duì)圖5中相對(duì)保留時(shí)間在21.9 min和35.6 min的物質(zhì)成分進(jìn)行了分析并確定為其降解產(chǎn)物成分。

甲醇提取液在色譜條件下有前延峰現(xiàn)象，選擇色譜流動(dòng)相（20%甲醇）稀釋，色譜峰峰型較好，與錢平[16]等研究結(jié)果一致。

圖6 甲醇含量對(duì)苦杏仁苷、野黑櫻苷提取得率影響Fig.6 Effects on extraction rates of the amygdalin and prunasin from the methanol content

圖7 超聲時(shí)間對(duì)苦杏仁苷提取得率的影響Fig.7 Effects on extraction rates of the amygdalin from ultrasonic time

圖8 料液比對(duì)苦杏仁苷提取得率的影響Fig.8 Effects on extraction rates of the amygdalin from solid-liquid ratio

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)長柄扁桃粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷的影響

采用甲醇提取長柄扁桃粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷，實(shí)驗(yàn)表明，純甲醇溶劑浸提長柄扁桃粕，提取液中不含有苦杏仁苷的降解產(chǎn)物-野黑櫻苷。當(dāng)提取溫度為20 ℃、料液比1：100、超聲功率200 W時(shí)，分別考察提取時(shí)間10、20、30、40、50 min對(duì)苦杏仁苷提取得率的影響。圖7可知，苦杏仁苷的提取得率隨提取時(shí)間的延長而增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到30 min、40 min時(shí)，苦杏仁苷提取得率變化不明顯；而提取時(shí)間為50 min時(shí)，提取得率有增加。考慮當(dāng)提取時(shí)間由30 min延長到50 min時(shí)，提取得率增加0.2%，而提取時(shí)間過短又容易導(dǎo)致提取不充分。綜合考慮能耗和提取得率因素，試驗(yàn)最終確定最佳提取時(shí)間為30 min。

2.2.3 料液比對(duì)長柄扁桃粕中苦杏仁苷與野黑櫻苷的影響

長柄扁桃仁和長柄扁桃餅（含油量≥8%）經(jīng)石油醚超聲去油、干燥后，甲醇超聲浸提。試驗(yàn)研究不同料液比（長柄扁桃粕 g/甲醇 mL）對(duì)長柄扁桃粕中苦杏仁苷及其降解產(chǎn)物提取特性影響。按1.2.3.2樣品前處理，稱樣 5 份，分別以料液比 1：50、1：100、1：150、1：200和1：250超聲提取后測(cè)定提取得率。結(jié)果如圖8所示：長柄扁桃粕中苦杏仁苷的提取得率隨料液比增加呈先增大后減小趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)1：200時(shí)，提取得率最高5.77%（質(zhì)量百分含量）。這可能是因?yàn)樵诹弦罕容^低時(shí)，溶液中滲透壓較低，溶質(zhì)不容易浸出，導(dǎo)致提取得率較低；當(dāng)增大料液比，滲透壓變大，提取得率隨之增大；但當(dāng)增加到一定值時(shí)，溶液中滲透壓對(duì)提取得率的影響不顯著，所以導(dǎo)致提取得率不再繼續(xù)增大。因此，確定最佳料液比為1：200。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性關(guān)系和檢出限

以20%甲醇為溶劑，將500 μg/mL的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋成0.5、1、5、10、20、50、100、200、300 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量10 μL，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程y=9.9868x-1.6653，R2=0.9999（n=3）。說明在0.50～300 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

樣品（編號(hào)RCS11）長柄扁桃粕由于其特殊制油工藝，粕中同時(shí)含有苦杏仁苷（平均質(zhì)量含量約3%）和野黑櫻苷（平均含量約0.29 mg/g）兩種成分。在上述分析條件下，根據(jù)其色譜信息，以信噪比S/N=3計(jì)，得苦杏仁苷檢測(cè)限為0.2 μg/mL；以信噪比S/N=10計(jì)，得苦杏仁苷定量限為 0.4 μg/mL。在飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[17]中，HCN在飼料原料最低限量為50 mg/kg，相當(dāng)于苦杏仁苷限量為 845 mg/kg（苦杏仁苷與氫氰酸換算系數(shù)16.9），在本方法的定量限內(nèi)。

以20%甲醇為溶劑，將500 μg/mL的野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)一步稀釋成0.3、0.5、1、5、10、20、50、100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量10 μL，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程y=15.796x-1.177，R2=0.9999（n=3）。說明在0.30～100 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

在上述分析條件下，根據(jù)RCS11樣品色譜信息，以信噪比S/N=3計(jì)，得野黑櫻苷檢測(cè)限為0.1 μg/mL；以信噪比S/N=10計(jì)，得野黑櫻苷定量限為0.2 μg/mL。

2.3.2 精密度

吸取100 μg/mL的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入色譜儀，同一色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積分別為：1031.2、1026.0、1027.7、1036.8、1060.9、1043.9，相對(duì)偏差（RSD）1.26%，說明色譜分析苦杏仁苷的方法具有良好的精密度。

吸取10 μg/mL的野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入色譜儀，同一色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積分別為：158.0、155.1、150.0、150.4、151.7、149.4，相對(duì)偏差（RSD）2.23%，說明色譜分析野黑櫻苷的方法具有良好的精密度。

2.3.3 重復(fù)性

2.3.3.1 長柄扁桃粕

稱取編號(hào)為CS35的長柄扁桃粕樣品6份，按照1.2.3.2和1.2.2的方法操作。試驗(yàn)表明，樣品CS35中只含有苦杏仁苷成分，不含野黑櫻苷。記錄苦杏仁苷峰面積分別為 608.1、588.7、605.5、590.4、603.6、589.8。苦杏仁苷平均含量5.58%，RSD為1.39% (n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.2 長柄扁桃仁

稱取編號(hào)為RCS25的長柄扁桃仁樣品6份，按照1.2.3.1和 1.2.2的方法操作。試驗(yàn)測(cè)定表明，樣品RCS25中只含有苦杏仁苷成分，不含野黑櫻苷。記錄苦杏仁苷峰面積分別為484.0、499.2、460.8、483.5、462.0、497.0?？嘈尤受掌骄?.45%，RSD為3.13%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 平均加標(biāo)回收率

2.3.4.1 長柄扁桃粕中平均加標(biāo)回收率

表1 長柄扁桃粕中平均加標(biāo)回收率及RSDTable 1 The amygdalin and prunasin recoverys from Amygdalus pedunculata Pall meal and its RSD（n=3）

表2 長柄扁桃仁中平均加標(biāo)回收率及RSDTable 2 The amygdalin and prunasin recoverys from Amygdalus pedunculata Pall kernel and its RSD（n=3）

稱取長柄扁桃粕（苦杏仁苷質(zhì)量含量5.67%，野黑櫻苷未檢出）10份，每3份作為一組，三組分別加入2.5、5.5、10.0 mg的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品，再分別加入0.1、0.2、0.5 mg的野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)品，1份留做空白，按照1.2.3.2方法處理，液相測(cè)定。計(jì)算長柄扁桃粕中平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

表1可知，甲醇（100%甲醇）溶液做提取劑，苦杏仁苷平均加標(biāo)回收率98.32%～107.99%，野黑櫻苷平均加標(biāo)回收率107.58%～117.60%，說明純甲醇溶液能同時(shí)提取出樣品中的苦杏仁苷和野黑櫻苷兩種物質(zhì)。同時(shí)證實(shí)了 2.2.1中低甲醇含量的提取液中由于水的存在，使部分苦杏仁苷降解為野黑櫻苷，如圖 6，低含量甲醇溶液中野黑櫻苷含量最高，苦杏仁苷含量最低，而純甲醇提取液中只有苦杏仁苷，說明此樣品中只含有苦杏仁苷成分。

2.3.4.2 長柄扁桃仁平均加標(biāo)回收率

稱取長柄扁桃仁（苦杏仁苷含量2.19%，野黑櫻苷未檢出）10份，每3份作為一組，三組分別加入4.0、5.5、10.0 mg的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品，再分別加入0.1、0.2、0.5 mg的野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)品，1份留做空白，按照1.2.3.1方法處理，液相測(cè)定。計(jì)算長柄扁桃仁中平均加標(biāo)回收率，結(jié)果見表 2，苦杏仁苷平均加標(biāo)回收率87.10%～96.19%，RSD為4.46%～7.83%（n=3）；野黑櫻苷平均加標(biāo)回收率 88.65%～103.10%，RSD為3.03%～7.55%（n=3）。

3 結(jié)論

本研究采用甲醇提取長柄扁桃仁及長柄扁桃餅、粕中的苦杏仁苷及其降解產(chǎn)物，確定了各原料的提取方法，并建立了高效液相色譜測(cè)定其中苦杏仁苷及野黑櫻苷含量的方法。長柄扁桃仁中苦杏仁苷平均加標(biāo)回收率 87.10%～96.19%（RSD 為 4.64%～7.83%），野黑櫻苷為88.65%～103.10%（RSD為3.03%～7.55%）；長柄扁桃粕中苦杏仁苷平均加標(biāo)回收率98.32%～107.99%（RSD為1.44%～3.36%），野黑櫻苷為 107.58%～117.60%（RSD 為 1.45%～2.26%），精密度1.26%，具有較好的重現(xiàn)性、較高的回收率和準(zhǔn)確性等。方法的建立對(duì)長柄扁桃及其副產(chǎn)物的開發(fā)具有很好的指導(dǎo)意義，對(duì)木本油料產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有更強(qiáng)的推進(jìn)作用。