細胞周期檢測點激酶與腫瘤的關(guān)系研究進展

郭愛葉，李 泮，高 嵐

(河南省人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450003)

人體每天都會有大量的DNA損傷，導致DNA損傷的原因主要是細胞內(nèi)DNA受到如紫外線、活性氧、化學試劑和電離輻射等外界因素或機體內(nèi)源性DNA復制時的應激反應的影響，導致DNA的化學結(jié)構(gòu)或編碼特性出現(xiàn)異常，進而引起基因組改變[1-2]。這種損傷若不能及時修復，就會對機體造成嚴重的健康威脅，甚至會導致腫瘤的發(fā)生。常見的2種細胞周期檢測點激酶(checkpoint kniase，Chk)是Chk1和Chk2，兩者在DNA損傷修復過程中發(fā)揮著極其重要的作用，其缺失或過度表達都有可能引起一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，影響腫瘤患者的預后。隨著Chk1和Chk2成為國內(nèi)外研究的熱點，Chk及其與腫瘤關(guān)系的研究也有了很大的進展，本文就近年來的研究進展進行綜述如下。

1 Chk概述

1.1 Chk基本結(jié)構(gòu)和功能Chk主要包括Chk1和Chk2，均屬蛋白激酶，具有相似的化學結(jié)構(gòu)和重合的底物譜[3]，但是在不同的腫瘤組織中這2種激酶卻有著不同的表達。

1.1.1 Chk1基本結(jié)構(gòu)和功能 Chk1最初在裂殖酵母菌中被發(fā)現(xiàn)，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，相對分子質(zhì)量約54 000[4]。人類Chk1基因在染色體11q24上被發(fā)現(xiàn)，其cDNA長度為1 891 bp左右，目前主要有7種轉(zhuǎn)錄變異體。Chk1蛋白由476個氨基酸組成，主要包括一個可催化底物磷酸化的N-末端激酶結(jié)構(gòu)域和一個可接受磷酸化調(diào)節(jié)的C-末端抑制性結(jié)構(gòu)域[5]。

Chk1是一種在進化上具有高度保守性的蛋白激酶，主要在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用，在人和多種動物的細胞質(zhì)和細胞核中都能發(fā)現(xiàn)其存在。Zachos等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，正常表達的Chk1基本不會影響體細胞的正常生長，但是當Chk1受到外界或內(nèi)部因素的影響發(fā)生基因突變或表達異常時，可能會導致細胞凋亡和DNA復制不完全，影響DNA的損傷修復，甚至可能由于Chk1表達異常，子代細胞攜帶不完全的基因并躲過了細胞自身的檢查，繼續(xù)增殖發(fā)育形成惡性增殖的細胞，最終導致腫瘤的發(fā)生。

Chk1能夠影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細胞周期和胚胎發(fā)生，細胞內(nèi)紡錘體和染色體的裝配過程也與Chk1有關(guān)。此外，Chk1蛋白激酶還能直接影響細胞的凋亡和DNA的修復，調(diào)節(jié)細胞的熱休克反應和細胞對蛋白質(zhì)錯誤折疊、人類免疫缺陷病毒感染等的應激反應[7-9]。

1.1.2 Chk2基本結(jié)構(gòu)和功能 Chk2是一種多功能蛋白激酶，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白，相對分子質(zhì)量約60 000，人類Chk2基因在染色體22q12.1上被發(fā)現(xiàn)，cDNA全長約2 061 bp，目前主要有8種轉(zhuǎn)錄變異體。Chk2蛋白由543個氨基酸組成，主要包括3個區(qū)域，分別為氨基酸對富含區(qū)、叉頭相關(guān)結(jié)構(gòu)域和近C末端的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。

Chk2在正常組織細胞中廣泛存在，在細胞周期的各個階段都發(fā)現(xiàn)了Chk2蛋白激酶，并且Chk2蛋白激酶具有顯著的組織特異性。與Chk1一樣，Chk2也能夠調(diào)節(jié)細胞周期，從而參與到DNA損傷修復過程中，維持染色體的穩(wěn)定。有研究[10]表明，在正常生長期間，Chk2通常在細胞核內(nèi)以無活性單體的形式存在，在沒有DNA損傷時，Chk2可以將乳腺癌易感性基因1(BRCA1)磷酸化，這有利于保持染色體的穩(wěn)定性和有絲分裂紡錘體組裝的正確性。當外界一些因素導致DNA損傷斷裂時，Chk2通過ATM依賴途徑中蘇氨酸68的磷酸化被激活[11-12]。

1.2 Chk與DNA的損傷反應DNA損傷反應是指當DNA大面積損傷并且不容易修復時，損傷感應器能觸發(fā)更為廣泛的反應，使細胞免受高水平DNA的持續(xù)損害，細胞內(nèi)信號通路被激活，傳遞損傷信號到各種效應蛋白。當細胞DNA損傷發(fā)生時細胞周期檢測點被激活，阻滯細胞周期并進行DNA的修復以及修復后的細胞周期重啟，主要涉及到四種蛋白激酶：Chk1、Chk2、毛細血管擴張性共濟失調(diào)突變蛋白(ataxia telangiectasia mutated,ATM)和ATM/Rad3相關(guān)蛋白(TAR)[13-14]。

1.2.1 Chk1與DNA損傷修復 在分子水平上，ATR-Chk1途徑能識別出包括離子輻射、DNA復制壓力、DNA單鏈的斷裂、病毒感染和DSB末端切除等多種DNA損傷[15]。在應對離子輻射或復制壓力引起的DNA損傷時，最主要的通路是TAR-Chk1-細胞分裂周期因子25(cell division cycle protein 25，Cdc25)通路，在此通路中，ATM和ATR作為DNA損傷應答反應中的重要感受器，能把DNA受損信號通過中介因子準確快速傳遞至Chk1，Chk1被激活后將DNA復制起始因子Cdc25磷酸化，使Cdc25加速泛素化降解，最終引起細胞周期停滯，為DNA損傷修復提供時間。Lu等[16]發(fā)現(xiàn)ATM也可以通過磷酸化Chk1的Ser317位點激活整個通路發(fā)揮DNA損傷修復作用。不僅如此，在雙鏈DNA斷裂反應中，Chk1激酶通過磷酸化TLK的Ser695位點參與到DNA的復制和損傷修復過程中[17]。

1.2.2 Chk2與DNA損傷修復 Chk2通過負調(diào)控機制在細胞周期的調(diào)控中發(fā)揮作用，當DNA受損尤其是DNA雙鏈斷裂時，可通過ATM-Chk2-Cdc25信號通路激活相應檢查點阻滯細胞周期進程，進行DNA損傷修復。在人類細胞中，Chk2通過特異性磷酸化BRCA1的Ser988位點使BRCA1從細胞核移動到細胞質(zhì)中，即改變BRCA1的核定位，被活化的BRCA1再參與到同源重組DNA修復通路中，同時抑制非同源末端連接。當DNA損傷由于某些原因無法被有效修復時，Chk2會通過P53依賴型和P53非依賴型2種途徑誘導含有受損DNA的細胞發(fā)生細胞凋亡，從而清除這些細胞[18]。

2 Chk與腫瘤

2.1 Chk1與腫瘤Chk1是重要的細胞周期檢測點的調(diào)節(jié)蛋白之一，其穩(wěn)定表達有利于DNA損傷修復機制的正常進行，有助于維持基因組的完整和穩(wěn)定[19]。當Chk1基因失活或表達異常時，DNA損傷修復不能正常進行，導致DNA損傷由于不斷進行復制而增加積累，這就使某些本應該生理性凋亡或正常生長增殖的細胞不斷進入細胞周期，最終形成惡性增殖的細胞，甚至導致腫瘤的發(fā)生[20]。有研究[9,21-24]發(fā)現(xiàn)，在正常細胞中Chk1蛋白激酶的表達較低，但是在人類肺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌和結(jié)腸癌等腫瘤細胞中有較高的表達，這提示Chk1蛋白激酶的高表達可能與這些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。衛(wèi)茹等[25]在對Chk1和Rad51蛋白在食管胃結(jié)合部腺癌組織中的表達及意義的研究中發(fā)現(xiàn)，Chk1蛋白的表達水平越高，患者的預后越差，2種蛋白具有協(xié)同促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

Chk1蛋白激酶能夠介導細胞DNA的損傷修復，對于正常的細胞來說這的確降低了由DNA突變引起的細胞惡性增殖的風險，但對于腫瘤細胞來說，Chk1蛋白激酶同樣也能修復由抗腫瘤藥物引起的DNA損傷，這令腫瘤細胞降低了對DNA損傷劑的敏感性，削弱了放、化療的療效。許多研究也間接證實了這一說法。學者們發(fā)現(xiàn)Chk1表達缺失的腫瘤細胞通常會表現(xiàn)出對DNA損傷劑的敏感性增加、細胞周期檢測點的阻滯作用消失和細胞增殖緩慢等缺陷[26-27]，而Chk1高表達的腫瘤細胞相較于Chk1低表達的腫瘤細胞在嚴酷的腫瘤微環(huán)境或DNA損傷的情況下有更強的適應能力。目前也有證據(jù)表明，Chk1基因缺失可能與乳腺癌相關(guān)基因及細胞的惡性生物學行為有關(guān)[28]。

2.2 Chk2與腫瘤目前多數(shù)學者認為Chk2基因?qū)儆谝职┗?，人類肺癌、卵巢癌等許多腫瘤細胞中Chk1蛋白水平有較高表達，與Chk1不同的是，Chk2激酶蛋白在許多腫瘤組織中表現(xiàn)為表達缺失，這影響了細胞周期的停滯或受損DNA的修復，可能導致無法阻滯突變的基因復制，并使腫瘤易感性提高，經(jīng)過長時間的異?；虻姆e累可能會導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。王一然等[29]在對Chk2基因突變與乳腺癌的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，Chk2基因是乳腺癌重要的易感基因之一。Jiang等[30]也在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Chk2基因座丟失。殷子然[31]在對25例卵巢癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，Chk2蛋白的異常表達可能與卵巢癌的形成密切相關(guān)。這說明Chk2的表達缺失與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。但是，在另一些研究中發(fā)現(xiàn)Chk2在某些原發(fā)性食管癌、胃癌、卵巢癌等惡性腫瘤中卻表現(xiàn)為高表達，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，這使得Chk2可能屬于抑癌基因的結(jié)論受到挑戰(zhàn)[32-33]。

3 Chk抑制劑與腫瘤治療

3.1 Chk1抑制劑與腫瘤治療Chk1蛋白激酶抑制劑根據(jù)其作用機制可分為ATP競爭性抑制劑和非ATP競爭性抑制劑，如AZD7762是一種有效的ATP競爭性抑制劑，在腫瘤細胞DNA損傷時，其可以阻滯細胞周期停滯和DNA修復，引起細胞凋亡。根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)的不同可將Chk1蛋白激酶抑制劑分為7類：喹啉酮類、脲類、吡咯并咔唑酮類、苗并吡唑類、吲哚類、含硫化合物和一些其他類型[34]。Chk1蛋白激酶抑制劑在臨床上的應用主要作為敏化劑，與一些放、化療藥物聯(lián)合使用，通過抑制Chk1蛋白激酶的功能來增加腫瘤細胞對放、化療藥物的敏感性，增強放、化療的療效。

Chk1蛋白激酶抑制劑還可以與其他一些藥物聯(lián)合使用通過產(chǎn)生“合成致死”效應來殺死腫瘤細胞，不僅如此，目前已有許多Chk1抑制劑單藥抗腫瘤的研究報道[35]，其中LY2606368已進入多種腫瘤治療Ⅱ期臨床試驗階段，有待進入Ⅲ期臨床試驗。由于第1代Chk1蛋白激酶抑制劑給藥途徑具有爭議，而且細胞毒性較強，所以其在臨床上的試驗被終止。

3.2 Chk2抑制劑與腫瘤治療與Chk1類似，Chk2蛋白激酶也能夠修復損傷的DNA，而Chk2蛋白激酶抑制劑則能夠抑制Chk2的表達，減弱Chk2對DNA損傷的腫瘤細胞的修復，增加腫瘤細胞對DNA損傷劑的敏感性，因此，Chk2蛋白激酶抑制劑可以與放、化療藥物聯(lián)合使用以增加放、化療對腫瘤細胞的損傷，不僅如此，其還能保護正常細胞，減弱放、化療對正常細胞的損傷。有研究[36]發(fā)現(xiàn)，Chk2抑制劑使具有P53缺陷的腫瘤細胞對基因毒性劑生物敏感性更強，這是由于同時缺少Chk2和P53會使G1/S、G2/M檢查點失效。主要的Chk2抑制劑包括VRX0466617、AZD 7762、AB C3742、PV1019、NCS10955、CCT241533、XL9844等[37]。其中AZD7762、NSC109555、小分子抑制劑C3742等已經(jīng)進入Ⅰ期臨床研究。值得一提的是，有學者指出，多數(shù)Chk2蛋白抑制劑不具有特異性，通常對Chk1蛋白激酶也有活性，這非但不能增加抗腫瘤藥物的效果，反而表現(xiàn)出對放、化療的抵抗作用[5]。

4 小結(jié)與展望

近年來，對Chk的研究取得了一定的進展，許多研究都表明，Chk1和Chk2是最常見的Chk，在細胞周期檢測機制中也發(fā)揮著十分重要的作用，兩者的基因或蛋白表達的異常可能會導致腫瘤的發(fā)生。90%已知腫瘤的組織中能夠同時檢測到Chk1和Chk2，但這2種蛋白激酶在不同腫瘤組織中表達情況并不完全相同，而且兩者是否與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)也尚無定論。由于Chk1抑制劑的特異性要優(yōu)于Chk2抑制劑，所以大量學者更傾向于對Chk1蛋白激酶抑制劑的研究。Chk1抑制劑和Chk2抑制劑都能夠起到提高腫瘤細胞對放、化療藥物的敏感性的作用，因此Chk與放、化療聯(lián)合應用于腫瘤的治療已成為近年來的研究熱點。但Chk抑制劑應用于臨床之前還要進行大量的研究。