外泌體標(biāo)志物和腫瘤液體活檢的研究進(jìn)展及現(xiàn)狀

林宇晟 甘進(jìn)鋒 江鈺琛 王飛寒 張灝

惡性腫瘤是世界公共衛(wèi)生中還未攻克的主要難題，有效的治療手段還非常有限。臨床上對于腫瘤的診斷，通常依靠組織活檢，需要非常專業(yè)的臨床醫(yī)生取材處理，操作難度大。液體活檢作為一種全新的手段，在樣本取材上明顯不同，不僅可針對血液，也可以選取唾液、胸腔積液、尿液等體液。液體活檢避免了手術(shù)開刀和穿刺對患者造成的傷害，在安全性上具有較大優(yōu)越性，操作難度也明顯較低，簡便易行［1]。該技術(shù)對腫瘤診斷、治療、預(yù)后等具有全程監(jiān)控的作用，實時性和時效性較強(qiáng)。

目前液體活檢領(lǐng)域的手段主要包括ctDNA、CTC、外泌體，以及細(xì)胞外游離核酸（RNA和DNA）［2-3]。外泌體是由胞吐作用釋放到細(xì)胞外的納米級細(xì)胞外脂質(zhì)雙層囊泡，直徑為30～150 nm，幾乎能被所有細(xì)胞類型在各種生理和病理條件下分泌到細(xì)胞外微環(huán)境［4-5]。外泌體攜帶的信息多種多樣，因此外泌體分子作為各種類型腫瘤的生物標(biāo)志物已成為腫瘤研究和轉(zhuǎn)化的關(guān)注點。盡管外泌體的內(nèi)容物和攜帶物也被不斷地重新定義［6]，但是外泌體具有的優(yōu)勢和獨特性，已經(jīng)證明其作為腫瘤和其他疾病標(biāo)志物的巨大潛力。

1 外泌體mRNA

信使RNA（mRNA）是一種攜帶遺傳信息并且能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的單鏈核糖核酸。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中的mRNA攜帶了大量腫瘤細(xì)胞遺傳信息，因此檢測外泌體中特異性mRNA既可用于診斷腫瘤，評估腫瘤進(jìn)展，也可用于監(jiān)測治療反應(yīng)。已有報道證實血漿外泌體中PD-L1 mRNA的表達(dá)水平與黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的PD-L1抗體免疫治療反應(yīng)相關(guān)［7]。該項研究證實了外泌體mRNA可作為一種可檢測腫瘤免疫治療且易獲得的生物標(biāo)志物，為臨床的治療方案選擇提供指導(dǎo)。尿液中外泌體的mRNA與前列腺癌細(xì)胞具有相同的轉(zhuǎn)錄組，癌組織與相應(yīng)患者尿液外泌體中CDH3的mRNA表達(dá)均下調(diào)［8]，因此尿液中外泌體的基因檢測可作為一種非損傷性檢測手段，代替活檢鑒別前列腺癌及單純前列腺特異性抗原（PSA）升高的疾病，提高臨床診斷的準(zhǔn)確性，有效減少不必要的損傷性治療手段。在前列腺癌與外泌體的其他研究中，也有許多證據(jù)表明mRNA與癌癥進(jìn)展［9]或重塑腫瘤微環(huán)境有關(guān)［10]，揭示了外泌體mRNA在前列腺癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。一方面，癌細(xì)胞分泌的外泌體mRNA可通過提升原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞惡性程度和“馴化”轉(zhuǎn)移灶微環(huán)境促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。另一方面，外泌體mRNA通過作用于靶癌細(xì)胞的相關(guān)基因而促進(jìn)癌細(xì)胞耐藥。另有研究報道，肺癌及胰腺癌患者血漿中外泌體hTERT的表達(dá)較健康對照組顯著升高［11]，說明外泌體mRNA對腫瘤早期診斷具有重要意義。以上研究結(jié)果提示，外泌體中的特異性mRNA可以有效診斷腫瘤，評估腫瘤預(yù)后，甚至具有指導(dǎo)臨床相關(guān)治療及用藥的潛在價值，值得進(jìn)一步探索。

2 外泌體嵌合RNA

嵌合RNA，又稱融合轉(zhuǎn)錄物，由2個或多個不同基因的外顯子相互連接組成。嵌合RNA及其編碼產(chǎn)物通常是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一［12]。腫瘤細(xì)胞外泌體通過攜帶嵌合RNA等功能性分子，以多種機(jī)制介導(dǎo)腫瘤進(jìn)程。本課題組在嵌合RNA的研究中，通過高通量篩查首次發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄異常剪接產(chǎn)生的嵌合RNA（命名為GOLM1-NAA35）在腫瘤中異常表達(dá)。深入分析發(fā)現(xiàn)這種嵌合RNA可通過外泌體分泌到唾液中，進(jìn)一步評估發(fā)現(xiàn)唾液外泌體GOLM1-NAA35水平可反映腫瘤生長狀況，能作為非侵入性診療手段以及早篩和預(yù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險評估的生物分子，成為ESCC潛在的診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物［13]。我們認(rèn)為外泌體嵌合RNA表達(dá)水平可反映腫瘤生長狀況以及作為癌癥風(fēng)險評估的生物分子，相信該發(fā)現(xiàn)將為腫瘤生物標(biāo)志物的研究提供重要推動力。外泌體嵌合RNA作為診斷標(biāo)志物逐漸受到關(guān)注，其高特異性和敏感性為腫瘤早期診斷作出了巨大貢獻(xiàn)，但是否能成為常用的臨床診斷標(biāo)志物的替代選擇，仍需在大樣本研究中進(jìn)一步驗證。

3 外泌體miRNA

miRNA是一種小的非編碼RNA分子，包含大約22個核苷酸。外泌體中的miRNA在眾多種類的RNA中含量最高，且因其不易被RNA酶降解而穩(wěn)定存在。相較于其他生物小分子，由于miRNA易富集，取材簡便等特點，成為目前外泌體研究中較多的一類生物小分子。miRNA作為生物標(biāo)志物在多種癌癥（包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌和前列腺癌等）的早篩、診斷和預(yù)后等方面的潛在應(yīng)用價值已有大量報道。有研究顯示microRNA-1246在侵襲性前列腺癌中可作為理想的診斷生物標(biāo)志物［14]。血清外泌體miR-375和miR-1307可作為有效的卵巢癌診斷潛在生物標(biāo)志物，聯(lián)合傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物CA125和HE4，可顯著提高診斷的特異性和準(zhǔn)確性［15]。還有研究指出血清外泌體中miRNA-638下調(diào)預(yù)示肝癌患者預(yù)后不良［16]；循環(huán)外泌體中 miRNA-125a-3p可作為早期結(jié)腸癌的診斷生物標(biāo)志物［17]。還有研究發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c在肝母細(xì)胞瘤患者中表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA-34可作為肝母細(xì)胞瘤患者診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物［18]。然而，這些研究提出的觀點或驗證的結(jié)果能否最終轉(zhuǎn)化而應(yīng)用于臨床，仍需科研工作者和臨床醫(yī)生的更多努力和合作。

4 外泌體lncRNA

長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度超過200個核苷酸且缺乏完整的開放閱讀框的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。在外泌體lncRNA作為腫瘤生物標(biāo)志物的相關(guān)研究中，有報道指出血清中分離得到的外泌體lncRNA HOTTIP可作為胃癌診斷的潛在生物標(biāo)志物，較CEA、CA19-9等傳統(tǒng)標(biāo)志物具有更高的準(zhǔn)確性，為胃癌提供了更具特異性的非侵入式診斷手段［19]。另外，在前列腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者尿液外泌體lncRNA-p21的表達(dá)較前列腺增生患者上調(diào)，可作為不同時期前列腺癌的診斷分子標(biāo)志物，有望用于臨床指導(dǎo)不同階段前列腺患者的個體化治療［20]。盡管目前l(fā)ncRNA作為腫瘤診斷或預(yù)后評估生物標(biāo)志物的研究尚處于起步階段，但外泌體中的lncRNA提取方便，在環(huán)境中能夠穩(wěn)定存在［21]，為進(jìn)一步深入研究提供了有利條件。

5 外泌體circRNA

環(huán)狀 RNA（circular RNAs，circRNA）是一類內(nèi)源性非編碼 RNA（non-coding RNA，ncRNA），區(qū)別于傳統(tǒng)的線性RNA，circRNA由反向剪接形成，是一種共價閉合的單股環(huán)狀分子。由于較高的保守性和穩(wěn)定性，circRNA具有更大的潛力成為診斷腫瘤的理想生物標(biāo)志物［22]。有證據(jù)表明胃癌組織中circR-002059顯著下調(diào)，其表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、性別和年齡等相關(guān)［23]。也有研究提出并驗證了circPVT1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，并且可通過“海綿吸附作用”調(diào)節(jié)miR-125家族成員而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖［24]，該研究認(rèn)為circRNA可以作為miRNA海綿間接調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為潛在的腫瘤發(fā)生預(yù)測指標(biāo)。

目前，circRNA已成為該領(lǐng)域研究的新熱點，其在腫瘤診斷、治療及預(yù)后評估中的潛在臨床價值正受到密切關(guān)注。circRNA的豐富、穩(wěn)定、保守、特異等特點，以及其反義互補(bǔ)序列和RNA結(jié)合蛋白（RBPs）可在circRNA的生物合成中產(chǎn)生重要的作用［25]，但大多數(shù)circRNA的降解和定位仍需進(jìn)一步研究證實。circRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明，在檢測和定性方法上仍存在局限性，不同的生物信息學(xué)方法或測序數(shù)據(jù)也會造成circRNA的識別出現(xiàn)偏差，因此其全長序列檢測技術(shù)仍有待進(jìn)一步發(fā)展。circRNA在腫瘤組織、血漿及唾液中的表達(dá)具有特異性，提示其在疾病診斷和治療中具有較好的臨床應(yīng)用價值，有望成為腫瘤早期診斷、預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物及腫瘤治療靶點。

6 外泌體piRNA

外泌體中除了含有多種短鏈RNAs和長鏈RNAs，還發(fā)現(xiàn)其中含有病毒RNA、tRNA、小核RNA、circRNA、piRNA及ncRNA。小非編碼RNA（sncRNA）包括miRNA和piRNA。在對外泌體來源的RNA進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，與miRNA相比，piRNA大小不同（26-31 nt），缺乏序列保守性且復(fù)雜性有所增加［26]。參與piRNA生物合成的piRNA和蛋白質(zhì)（例如PIWI家族蛋白）的失調(diào)已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括乳腺癌［27]，突出了piRNA介導(dǎo)的表觀遺傳事件在人類體細(xì)胞癌變過程中的新興作用。通過測序量化體液中提取的外泌體含量，發(fā)現(xiàn)與miRNA和mRNA相比，piRNA僅占了總量的極小一部分。目前piRNA與腫瘤的關(guān)系尚沒有清晰的研究體系，還需更多證據(jù)驗證外泌體源性的piRNA與腫瘤發(fā)展的關(guān)系。

7 外泌體蛋白

近年來，隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的普及，越來越多來自各種細(xì)胞培養(yǎng)基和體液（如血漿、尿液、胸腔積液、腹水、前列腺液、乳汁、乳頭溢液等）的外泌體蛋白的組成和功能相繼被揭示，其在預(yù)測腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也越來越受到重視。

多項研究表明外泌體攜帶的蛋白質(zhì)在不同腫瘤中存在差異性表達(dá)。有研究顯示非小細(xì)胞肺癌患者的血清外泌體會呈遞過表達(dá)的蛋白，其中NY-ESO-1、EGFR、PLAP、EpCam和Alix等過表達(dá)與較短的總生存期密切相關(guān)［28]。一項研究利用蛋白組學(xué)手段，從乳腺癌患者血漿外泌體中鑒定出144個高度磷酸化的蛋白，其中 3 個蛋白（RALGAPA2、PKG1、TJP2）在乳腺癌患者中的磷酸化水平更高，認(rèn)為血液中外泌體磷酸化蛋白的組成可能為乳腺癌診斷和預(yù)后提供新的標(biāo)志物［29]。最近，來自范德堡大學(xué)的研究者對外泌體的蛋白成分進(jìn)行了重新定義，其將外泌體從其他類型的細(xì)胞外囊泡中分離出來，隨后進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)和核酸分析，認(rèn)為外泌體中并沒有重要的miRNA加工蛋白Argonautes（Agos），以及其他具有RNA分選作用的RNA結(jié)合蛋白（RBPs），同時缺乏細(xì)胞骨架元素和常見的糖酵解酶，這表明外泌體的裝載是一個高度調(diào)控的過程［6]，顯示了外泌體結(jié)構(gòu)和組成的獨特性，這一結(jié)果有待今后更多的研究驗證和評價。

以上研究結(jié)果說明來自體液的外泌體會選擇性地富集癌癥病變的特征性蛋白，針對這些蛋白的檢測可能對疾病診斷有一定意義，但這些外泌體蛋白標(biāo)志物在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用有待進(jìn)一步驗證。

8 外泌體DNA

相較外泌體中豐富的RNA含量，也有少數(shù)報道發(fā)現(xiàn)某些特殊來源的外泌體包含DNA分子，包括基因組DNA和線粒體DNA（mtDNA）［30-31]。外泌體中包含的DNA很大程度上與其來源腫瘤細(xì)胞中的DNA保持一致的狀態(tài)，提示外泌體DNA可作為檢測致癌性突變的有效生物標(biāo)志物［32-34]。有研究［33]表明嗜鉻細(xì)胞瘤（PCC）和副神經(jīng)節(jié)瘤（PCL）患者的外泌體含有能反映易感基因突變狀態(tài)的雙鏈DNA（dsDNA），且?guī)缀醺采w所有染色體，還指出外泌體dsDNA存在的明確證據(jù)，顯示其可作為一種非侵入性生物標(biāo)志物用于PCCs和PGLs的遺傳診斷和術(shù)前評估，且是最有效的體細(xì)胞突變篩查手段之一。另外一項研究指出，外泌體可以儲存完整的線粒體基因組，這些細(xì)胞外小泡反過來可以將它們的mtDNA轉(zhuǎn)移到代謝受損的細(xì)胞，從而恢復(fù)代謝活動［35]。然而，也有研究不認(rèn)為外泌體是細(xì)胞外DNA分泌的載體。來自范德堡大學(xué)的一項研究表明dsDNA和DNA結(jié)合組蛋白不存在于外泌體甚至其他類型的細(xì)胞外囊泡中，認(rèn)為細(xì)胞外dsDNA和組蛋白的活躍分泌是通過自噬和多泡內(nèi)體（MVEs）依賴的機(jī)制發(fā)生，而不依賴于外泌體［6]?？梢娡饷隗w中DNA的存在與否以及其來源和產(chǎn)生目前尚存爭議，有待驗證。

9 展望

相對于其他兩種液體活檢技術(shù)（ctDNA和CTC），外泌體在體液中濃度較高，有利于腫瘤的早期診斷；脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)對所含核酸分子起到良好的保護(hù)作用，具有較高的穩(wěn)定性；信息量更大，包含了與來源腫瘤細(xì)胞相似的蛋白質(zhì)及核酸，是一種可從多層面發(fā)現(xiàn)腫瘤特異的分子標(biāo)志物［36]，但目前外泌體相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物還有待進(jìn)一步發(fā)掘。

外泌體的結(jié)構(gòu)和組成有其獨特性，在機(jī)體內(nèi)部具有良好的生物穩(wěn)定性和生物相容性、低免疫原性和低毒性，用于生物標(biāo)志物研究的潛力巨大［37]。在將來，對新型外泌體生物標(biāo)志物的系統(tǒng)鑒定模式需要進(jìn)一步開發(fā)。鑒于現(xiàn)今能用于指導(dǎo)臨床的成熟外泌體生物標(biāo)志物有限，大量臨床信息如生存時間、復(fù)發(fā)狀況和藥物應(yīng)答等十分緊缺，證實生物標(biāo)志物在早期診斷、預(yù)后和用藥中的作用，還需要更多的臨床試驗驗證。此外，外泌體及其內(nèi)容物的生物起源和作用機(jī)制尚存爭議，對其進(jìn)一步研究，有助于指導(dǎo)生物標(biāo)志物的開發(fā)和藥物設(shè)計，并最終反饋促進(jìn)對機(jī)制的理解。

由于外泌體核酸分子提取和檢測技術(shù)相對成熟，目前對外泌體標(biāo)志物的研究主要集中在核酸分子。而外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)志物的研究，對外泌體分離的質(zhì)量要求極高，依照現(xiàn)階段技術(shù)提取的外泌體蛋白質(zhì)往往攜帶污染蛋白，且外泌體蛋白質(zhì)豐度相對較低，難以檢出其表達(dá)［38]。以上因素嚴(yán)重制約了外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)志物研究的推進(jìn)和臨床轉(zhuǎn)化。但是，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，將極大促進(jìn)外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)志物的研究，有望發(fā)現(xiàn)更多特異、靈敏的外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)志物。外泌體及其內(nèi)容物的提取、低豐度RNA、DNA或蛋白的放大，以及高效、高敏、高特異性的生物信息學(xué)分析方法，在未來的外泌體生物標(biāo)志物發(fā)展中尚需不斷調(diào)整、標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化。外泌體技術(shù)的臨床應(yīng)用研究仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，同時也伴隨著誕生無數(shù)新發(fā)現(xiàn)和新技術(shù)的可能性，其在惡性腫瘤中的精準(zhǔn)治療應(yīng)用已凸顯巨大潛力，期待外泌體在腫瘤液體活檢領(lǐng)域中的研究應(yīng)用，能讓患者獲益更多。