CD4+細胞毒性T細胞在臨床HIV感染中的研究進展

李 靜，周明菊，張和倩，宋錦文，張 超，王福生

經典的CD4+T細胞主要在抗體產生、抗原特異性CD8+T細胞活化、免疫調節(jié)等過程中發(fā)揮輔助功能。具有直接細胞毒性的CD4+T細胞最早在同種異體免疫排斥反應中得以描述，這種現(xiàn)象在很長時間內被認為是由于體外培養(yǎng)產生的假象[1]。經系列研究發(fā)現(xiàn)，CD4+細胞毒性T細胞（CD4+cytotoxic T cells, CD4 CTLs）在人和小鼠中廣泛存在[2]。CD4 CTLs通過II類人類白細胞抗原（human leucocyte antigen-II, HLA-II）依賴、抗原特異性的方式識別靶細胞，分泌細胞毒性物質如顆粒酶、穿孔素等發(fā)揮殺傷效應。CD4 CTLs也進一步被證實在病毒感染[2]、腫瘤[2-4]、自身免疫病[2，5-6]、疫苗接種[7]等過程中發(fā)揮重要作用。尤其是在感染性疾病中，包括流感病毒、巨細胞病毒、EBV、人類乳頭瘤病毒及HIV等都已有廣泛報道。近年來，隨著單細胞組學技術的應用，如單細胞轉錄組測序、質譜流式、T細胞受體（T-cell receptor, TCR）的單細胞層面測序分析等，大大促進了對CD4 CTLs譜系分化、功能特點的認識。在HIV感染中，新近研究表明CD4 CTLs在病毒控制中發(fā)揮了非常重要的作用，并展現(xiàn)出非常好的免疫治療應用前景。本文將圍繞近年來國內外有關CD4 CTLs及其在臨床HIV感染中的作用的重要研究進展進行綜述。

1 CD4 CTLs的表型與分化機制

經典的免疫學理論中T細胞在胸腺中發(fā)育成兩個主要的亞群：HLA-II依賴的CD4+Th和HLA-I依賴的CD8+細胞毒性T細胞（CD8+cytotoxic T cells, CD8 CTLs）。CD4+Th主 要受Th誘導含有BTP / POZ結構域的Kruppel樣鋅指轉錄因子（Th-inducing BTB/POZ domaincontaining Kruppel-like zinc-finger transcription factor, ThPOK）控制，而CD8 CTLs主要受Runt相關轉錄因子3（Runt related transcription factor 3,RUNX3）調控。ThPOK和RUNX3互相拮抗，共同調控T細胞的分化[8]。CD4 CTLs的轉錄調控與CD8 CTLs更為接近，在CD4 CTLs中，ThPOK的活性受到抑制，RUNX3活性上調[2]，這種轉變也依賴鋅指結構轉錄因子家族的成員MAZR對ThPOK 沉默子的調控[9]。

CD4+Th有非常高的異質性，可進一步分為Th0、Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、濾泡輔助性T細胞（follicular helper T cell, Tfh）、調節(jié)性T細胞（regulatory T cells, Tregs）等亞群，不同的亞群分別對應不同的分化調控信號、關鍵轉錄因子、效應細胞因子和功能[7]。不同CD4+Th亞型細胞其表型也并不是一成不變，在特定生理、病理條件下還能夠相互轉化[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分CD4+T細胞能夠在胸腺外進一步分化為具有類似CD8 CTLs和NK細胞的直接細胞殺傷功能的亞群。CD4 CTLs在不同的病理條件下，主要在機體外周、腸道和肺等相應病灶部位存在[10]，可從Th0[2，11]、Th1、Th2[2]、Th17[2]以及 Tregs[2，12]等效應性亞群分化而來。

CD4 CTLs的表型界定目前主要根據(jù)其功能性，包括類似CD8 CTLs和NK細胞中細胞殺傷功能相關的因子，如轉錄因子T-bet、Eomes，效應因子顆粒酶、穿孔素、CD107a和殺傷調控分子NKG2A、NKG2C、NKG2D、KLRG1等。一直以來，對CD4 CTLs的分化缺乏系統(tǒng)認識。Takeuchi等[10]發(fā)現(xiàn)，一小部分初始CD4+T細胞在激活后表達I類限制性T細胞相關分子（class I-restricted T cell-associated molecule, CRTAM），CRTAM+T細胞在培養(yǎng)后分泌IFN-γ，表達細胞殺傷毒性相關基因，在IL-2存在條件下，高表達穿孔素，并表現(xiàn)出細胞毒性功能，由此表明CRTAM+T細胞是CD4 CTLs的前體。值得注意的是，CRTAM也是CD8 CTLs和NK細胞的早期活化標志物[2]。此外，CD4 CTLs上低表達CD27和CD28，表現(xiàn)為已高度分化、終末期的T細胞表型，這可能與持續(xù)的抗原刺激與慢性炎癥的微環(huán)境相關[2]。近來Patil等[13]通過單細胞轉錄組分析的研究顯示，CD4+T細胞中毒性相關基因富集在CD4+TEMRA（CD3+CD4+CD45RA+CCR7-）亞群。此外，還鑒定出CD4+TEMRA亞群中IL-7Rhigh的細胞為CD4 CTLs的前體細胞。

2 CD4 CTLs的細胞毒性效應機制

2.1 經典途徑 CD4 CTLs發(fā)揮作用的兩種經典的細胞毒性效應機制與CD8 CTLs和NK細胞類似。第一種是Fas/FasL介導的途徑，效應細胞表面表達的Fas配體（如FasL、CD95L、CD178）與靶細胞上表達的同源Fas受體CD95連接，靶細胞上Fas的三聚體導致胞內FADD/caspase8/c-FLIP誘導死亡信號復合體的重新招募，最終導致caspase3介導的凋亡細胞的死亡[7]。第二種是穿孔素/顆粒酶途徑，細胞毒素顆粒在特異性TCR信號傳導后發(fā)生胞吐作用，成孔蛋白穿孔素是這些顆粒中作用最好的細胞毒性分子，它能夠將細胞毒素分子如顆粒酶和顆粒溶素直接轉移到靶細胞中。上述兩種途徑并不互斥，可共同發(fā)揮作用，但其偏好會受到刺激信號強度及局部微環(huán)境的影響。例如，在高濃度特異性抗原且IL-2缺失的條件下，CD4 CTLs更傾向于采用Fas/FasL通路殺傷靶細胞；在低抗原濃度有IL-2存在的條件下，傾向于采用穿孔素/顆粒酶途徑介導的殺傷[14]。

2.2 非經典途徑 除上述的兩種途徑外，可能還存在其他非經典殺傷途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在同時有Fas/FasL和穿孔素表達缺陷的CTL中仍具有部分細胞毒活性，進一步對CD4 CTLs克隆和殺傷途徑的殺傷性進行檢測，發(fā)現(xiàn)穿孔素和Fas途徑僅占其殺傷性的40%[15]。

2.2.1 分泌型、膜型的TNF-α和淋巴毒素 TNF-α和淋巴毒素（lymphotoxin, LT）都存在分泌型和膜型兩種形式。它們都可以介導靶細胞的死亡。在CD4 CTLs膜上存在膜型TNF-α和LT，它們能以類似Fas/FasL的方式介導靶細胞的殺傷[16]。

2.2.2 與TNF相關的殺傷途徑 與TNF類似稍弱的凋亡誘導物（TNF-like weak inducer of apoptosis,TWEAK）屬于TNF超家族，由249個氨基酸組成，屬于二型膜蛋白，胞內段與TNF極相似。可溶性TWEAK可誘導靶細胞凋亡，此殺傷途徑可被caspase抑制劑所阻斷。它也能表達于CD4 CTLs上，參與誘導靶細胞的凋亡，以此途徑殺傷激活的巨噬細胞。其殺傷途徑與TNF類似，但殺傷能力較弱。

TNF相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL），也屬于TNF超家族，具有與FasL類似的誘導靶細胞凋亡的能力。其分布比FasL更廣泛，能誘導許多細胞，尤其是血源性細胞的凋亡。TRAIL可表達于CD4 CTLs表面，參與誘導激活的巨噬細胞的凋亡，也可殺傷對Fas/FasL途徑有抗性的黑色素瘤細胞[16]。

2.2.3 其他 Ohminami等[17]發(fā)現(xiàn)一個急性髓性白血病相關的DEK-CAN 融合蛋白特異性CD4 CTLs克隆，能以一種非Fas、非穿孔素、非凋亡的方式，對靶細胞進行直接快速的殺傷。這可能是一種全新的CTL殺傷途徑。

3 HIV感染中CD4 CTLs的表型及功能特點

3.1 CD4 CTLs與CD8 CTLs的協(xié)同作用 CD8 CTLs介導的特異性細胞免疫被認為是宿主控制急性及慢性感染最重要的途徑。已有研究報道，在HIV感染急性期，CD8 CTLs的出現(xiàn)伴隨著病毒載量的急劇下降[18]。研究發(fā)現(xiàn)，HIV特異性CD8 CTLs識別的表位主要處于包膜蛋白區(qū)，而包膜蛋白區(qū)具有非常高的變異性，因此病毒極易發(fā)生逃逸[19]。首先，病毒能夠通過多種方式逃逸CD8 CTLs的識別，例如下調被感染宿主細胞表面的HLA-I的表達[20]，此外，病毒還能夠產生和積累突變的表位，逃逸CD8 CTLs的識別和殺傷[21]。HIV感染導致CD4+T細胞進行性減少和免疫缺陷，但在多種病毒感染過程中，CD4 CTLs也被證實對疾病的控制至關重要。CD4 CTLs對靶細胞的識別依賴HLA-II，相較CD8 CTLs依賴的HLA-I、HAL-II遞呈的抗原可以有更大的多樣性和數(shù)量[22]，降低了病毒逃逸識別表位的可能性[23]。因此CD4 CTLs是宿主抗病毒細胞免疫的重要補充，與CD8 CTLs發(fā)揮協(xié)同作用。

3.2 CD4 CTLs與HIV感染控制的關系 目前CD4 CTLs相關的研究主要是HIV感染的臨床病例觀察，尚無臨床試驗開展。最近越來越多的研究表明，HIV特異性CD4+T細胞在控制HIV復制中可能起關鍵作用[24-26]，尤其在HIV特異性CD8+T細胞應答效率較低的情況下[27]。在HIV-1感染的初期，效應性CD4+T細胞的出現(xiàn)，不僅與急性期病毒載量的變化曲線相關，并且與早期病毒載量的最低值相關，表明它參與了病毒的早期控制[7，28]。許多研究團隊針對HIV感染的不同階段進行了研究，在早期的研究者中，Appay等[29]檢測到HIV-1感染初期的患者體內有大量表達穿孔素、GzmA、GMP-17/TIA-1的CD4+T細胞，在慢性感染期會升至更高水平。Johnson等[28]發(fā)現(xiàn)在HIV-1感染的疾病早期（primary HIV-1 infection, PHI）的HIV特異性 CD107a+CD4+T細胞中，CD107a+IFN-γ+CD4+T細胞與HIV特異性CD8 CTLs共享轉錄譜，包括GzmA、B、K和穿孔素的表達，最重要的是HIV特異性CD107a+CD4+T細胞表現(xiàn)出與HIV特異性CD8 CTLs類似的殺傷活性[28]。除此之外，Soghoian等[27]對PHI的未治療個體進行了縱向研究，發(fā)現(xiàn)在感染12個月內病毒復制得到控制的個體與病毒未得到控制的個體相比，HIV特異性CD4+T細胞顯著擴增。與非控制者相比，病毒控制者（即長期無進展者）在Gag特異性CD4+T細胞上具有更高的脫顆粒標記CD107a的表達，并且在基線期時有GzmA+HIV特異性CD4+T細胞應答[7，27]，同樣的現(xiàn)象在猿猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）動物感染模型中也得到驗證，在刪除了CD8+T細胞的獼猴中，CD4 CTLs能夠控制SIV的復制[30]。Sacha等[31]發(fā)現(xiàn)，在精英控制者恒河猴體內用抗體去除CD8+T細胞后，可重新建立Gag和Nef特異性的CD4+T細胞應答實現(xiàn)對病毒的控制。總之，以上這些研究結果肯定了CD4 CTLs在控制HIV復制和延緩疾病進展方面的作用，詳情見表1。

表1 CD4 CTLs在不同類型的HIV患者中的表型及功能Table 1 Phenotype and function of CD4 CTLs in different groups of HIV patients

HLA的基因型與HIV的感染控制極其相關。最為熟知的是在精英控制者中HLA-B57、HLA-B27、HLA-B81等HLA-I類分子亞型與HIV感染更好的控制相關[32]。此外，Benati等[33]最早報道了一類能夠識別HIV主要免疫表位Gag293的CD4 TCR，這類TCR能夠與多類HLA-DR分子結合，因此也被稱作公共TCR。CD4+T細胞的公共TCR具有非常高的抗原結合活性，其存在也是很多精英控制者共有的基因型特征。Galperin等[34]進一步的研究表明，這類公共TCR接受不同HLA-DR遞呈的Gag293后，賦予CD4+T細胞毒性功能，可直接殺傷HIV感染的細胞。廣泛的HLA-DR交叉限制很可能在HIV感染中具有保護作用，因為它增加了單個個體表達多種限制性HLA-DR等位基因的表位檢測概率，轉移表達高親和力公共TCR的CD4+T細胞可促使HIV感染的靶細胞裂解，可作為免疫治療的工具在遺傳背景不同的患者身上實施，以達到HIV的功能性治愈。

HIV也能夠通過CD4分子和共受體感染CD4 CTLs細胞。隨著疾病的進展，CD4 CTLs的數(shù)量也會隨著總CD4+T細胞的減少而減少。這點艾滋病與其他感染性疾病有所不同，因此預期CD4 CTLs在HIV感染疾病慢性進展期的作用較小，相關的研究并不多。目前尚無關于CD4+T細胞計數(shù)低于50的患者研究。經過抗反轉錄病毒治療（anti-retroviral therapy, ART）的患者，其體內HIV特異性CD4 CTLs在疾病早期增多，抑制病毒的復制，控制疾病進展[21]（如表1）。在HIV感染中，CD4 CTLs除了對病毒感染細胞進行直接識別和殺傷外，也能以非細胞毒性機制發(fā)揮作用，Buggert等[21]近期發(fā)現(xiàn)體內T-bet和Eomes雙陽性的CD4 CTLs細胞是產生β-趨化因子的主要CD4+T細胞亞群，其分泌的β趨化因子MIP-1α和MIP-1β能夠競爭性結合CCR5，抑制HIV入侵。另有文獻報道，CD4 CTLs與常規(guī)CD25+FoxP3+CD4+T 細胞相比對HIV感染更耐受[35]，機制也可能如此，因此有研究認為這些功能特性提高了機體對HIV感染的抵抗力[36]。

3.3 CD4 CTLs在HIV疫苗設計中的應用 在探索HIV治愈策略中誘導保護性抗體和CD8+T細胞應答是預防HIV感染的主要疫苗策略，而特異性CD4+T細胞反應是誘導產生有效抗體和CD8+T細胞應答的關鍵。部分病毒特異性CD4+T細胞可能作為HIV感染的首要靶點，在獼猴艾滋病模型中，疫苗誘導的病毒特異性CD107a-CD4+T細胞在感染HIV后大量減少，但這項研究同時發(fā)現(xiàn)，疫苗誘導的CD107a+CD4+T細胞在病毒攻擊后較少耗竭，這意味著誘導這群細胞可能是治療艾滋病的另一種途徑[37]。有研究證實記憶性CD4+T的次級免疫效應功能高度依賴于炎癥環(huán)境，而IL-12和I型IFN的阻斷對記憶性CD4+T細胞的效應性分化有相反作用，進一步探討炎癥環(huán)境是如何影響它的次級免疫效應將使人們更好的了解目前的疫苗策略。記憶性CD4+T細胞在參與首次和次級免疫應答過程中介導的保護機制可能是不同的，在制定有效的疫苗接種策略時須更好的了解記憶性CD4+T細胞介導的病原體清除的功能機制，同樣對相關細胞因子作用途徑的研究也十分必要[38]。

3.4 組織中CD4 CTLs的特點 關于HIV-1感染者外周血方面的研究已有較多報道[8]，淋巴細胞主要存在于淋巴器官中，外周血中淋巴細胞的含量僅占總淋巴結的2%，而淋巴器官又是HIV主要的病毒庫[21，39]，所以淋巴結中是否也存在特異性的CD4 CTLs，以及其在HIV-1感染中發(fā)揮的作用是一個非常重要的問題。另有研究報道，在腸道黏膜組織中及炎癥部位可顯著觀察到CD4 CTLs的存在，并可能在抗感染和免疫反應中發(fā)揮作用[10]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，在HIV感染者外周血中存在大量的CD4 CTLs，但在急性感染早期淋巴結中僅存在極少量的CD4 CTLs，而在慢性期的淋巴結中幾乎不存在，所以HIV特異性CD4 CTLs可能并不是淋巴結中控制病毒的主要成分。淋巴結中β趨化因子的產生缺乏，也說明了其在HIV的控制中作用甚微。在感染后病毒血癥高峰期間，HIV特異性CD4 CTLs應答在外周血中最高，且與T-bet、穿孔素、MIP-1α等的產生增加相符[21]。值得注意的是，先前研究表明淋巴結中的T細胞在獲得細胞毒性后從組織進入血液，盡管慢性淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒感染患者淋巴結中特異性CD8+T細胞在急性感染期間可脫粒，但它們并不能有效的殺傷靶細胞[21，40]。該研究結果也適用于慢性HIV感染患者的數(shù)據(jù)，表明不同亞群的CD4+T細胞在淋巴結和外周血之間存在著脫?，F(xiàn)象，但細胞毒性分子表達水平低且免疫突觸受損，它們傾向于CXCR5+表型，提示是一種獨特的Tfh亞群脫粒，這種與眾不同的表型，至少不是與細胞毒性因子和β趨化因子分泌功能相關，意義還有待進一步研究。本文對文獻中已報道的在HIV感染中CD4 CTLs的表型及功能等做了梳理，詳見表1。

4 小 結

CD4 CTLs是一種非常重要的免疫效應細胞，廣泛參與感染性疾病的免疫應答過程。在HIV感染中，病毒特異性CD4 CTLs通過分泌多種細胞毒性介質發(fā)揮殺傷作用以保護機體，但是它優(yōu)先耗盡的事實使人對其有效的促進HIV控制的能力產生懷疑；CD4 CTLs在HIV感染早期可以控制病毒的復制，但在疾病急性期病毒特異性CD4+T細胞介導的各種短期和長期抗病毒作用的相互作用仍須深入探索；在慢性感染期它依然存在，在感染晚期可能啟動免疫功能來控制病毒血癥，但最終會喪失，提示可能存在替代因子在疾病進展的后期發(fā)揮作用，但這些反應的動力學和特征尚未得到評估；表達抗原高親和力、廣泛交叉限制性的公共TCR CD4+T細胞，分化為CD4 CTLs直接殺傷HIV感染的細胞，能夠控制HIV的控制者是否表現(xiàn)出MHC-II介導的選擇壓力，是否可通過治療干預來增強這些反應，這些都值得進一步研究，為HIV感染的治愈探索新策略。