線性探針技術(shù)診斷HIV/結(jié)核分枝桿菌感染者結(jié)核菌耐藥性效能評(píng)價(jià)

韋善求，麻秋英，羅順達(dá)，倪祖彥，韋善君

結(jié)核病是HIV感染者最常見的機(jī)會(huì)性感染疾病，也是艾滋病患者死亡的重要原因之一。WHO數(shù)據(jù)顯示，2015年約35%的艾滋病相關(guān)死亡病例是由于結(jié)核病所致，在資源受限地區(qū)有近50%患者死亡前沒有得到診斷[1-2]。臨床研究顯示早期診斷和有效的抗結(jié)核治療是降低HIV/結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）感染者病死率的重要措施[3]。目前傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和藥物敏感（藥敏）試驗(yàn)仍然是我國診斷和評(píng)判結(jié)核病療效的主要手段與金標(biāo)準(zhǔn)，但過程長達(dá)2～3個(gè)月，不能滿足臨床快速診斷需要。近年來DNA測(cè)序技術(shù)在MTB及其耐藥性診斷中得到推廣應(yīng)用，其檢驗(yàn)結(jié)果直觀可靠，能在1周內(nèi)完成檢測(cè)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施及技術(shù)要求高，難以在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣應(yīng)用。線性探針技術(shù)（line-probe assay, LipA）是基于核酸雜交的一種檢測(cè)技術(shù)，通過檢測(cè)MTB耐藥特定基因rpoB的8l bp核心區(qū)域、katG密碼子和inhA啟動(dòng)子的基因突變，預(yù)測(cè)RFP、INH耐藥表型。常用的試劑盒是GenoType MTBDRplus，可以對(duì)涂陽痰標(biāo)本或分離株進(jìn)行檢測(cè)，在6 h內(nèi)獲得結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的診斷。該技術(shù)操作難度不大，具有二級(jí)以上生物安全資質(zhì)的普通基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室均可以開展。LipA應(yīng)用于肺結(jié)核病患者的耐藥性檢測(cè)具有較高的敏感度和特異性，是WHO推薦應(yīng)用的分子生物學(xué)方法之一[4]。

HIV感染者免疫系統(tǒng)嚴(yán)重受損，繼發(fā)MTB感染的病理改變與HIV陰性MTB感染者的表現(xiàn)差異顯著。LipA應(yīng)用于HIV/MTB感染者的MTB耐藥檢測(cè)是否與結(jié)核病總體人群一致值得探討。本研究采用GenoType MTBDRplus試劑盒對(duì)HIV/MTB感染者涂陽痰標(biāo)本及臨床分離株進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)LipA對(duì)HIV/MTB感染者的檢測(cè)效能，同時(shí)進(jìn)一步了解廣西地區(qū)HIV/MTB感染者耐藥MTB的基因型特征，為抗結(jié)核治療和耐藥防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 檢測(cè)標(biāo)本取自2012年1月—2017年12月在南寧市第四人民醫(yī)院、柳州市龍?zhí)夺t(yī)院及廣西疾病預(yù)防控制中心治療的HIV/MTB感染者148例，其中107例為藥敏試驗(yàn)的臨床分離株，41例為涂陽痰標(biāo)本（金銨“O”或萋爾-尼爾遜染色），質(zhì)控菌株H37Rv（ATCC27294）由中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HIV感染的診斷依據(jù)《艾滋病診療指南（第三版）》[5]；②MTB的診斷依據(jù)《肺結(jié)核診斷和治療指南》[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除非結(jié)核分枝桿菌感染的患者。

1.2 儀器與試劑 萋爾-尼爾遜及金銨“O”染色液、改良羅氏培養(yǎng)基、藥敏試驗(yàn)及菌型鑒定采用的培養(yǎng)基均購自珠海BASO公司，培養(yǎng)基內(nèi)藥物終濃度為異煙肼（isoniazid, INH）1 μg/ml和10 μg/ml， 利 福 平（rifampicin, RFP）50 μg/ml和250 μg/ml，對(duì)硝基苯甲酸 500 μg/ml，GenoType MTBDRplus試劑盒購自德國Hain Lifesciences公司；RCR擴(kuò)增儀購自Biometra；TwinCubator雜交儀購自Hain Lifesciences公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 分離培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)和菌型鑒定依據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》操作[7]，LiPA依據(jù)GenoType MTBDRplus試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 耐藥判定及其相關(guān)定義 rpoB+katG和/或inhA突變判定為耐多藥（multi drug resistant,MDR）；katG 或inhA突變判定為耐INH；rpoB突變判定為耐RFP；無rpoB、katG和inhA突變判定為敏感；MDR是指對(duì)一種以上的抗結(jié)核藥物至少包括RFP和INH同時(shí)耐藥。

1.3.3 耐藥基因擴(kuò)增及測(cè)序 測(cè)序DNA制備與LipA核酸制備方法一致， H37Rv的katG、inhA基因序列來自GeneBank數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlmnih.gov），根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物（表1）。引物的合成、DNA擴(kuò)增和測(cè)序由上海生工生物公司完成。采用DNAman 8.0軟件中的Multiple Alignment將測(cè)序結(jié)果與H37Rv株基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定基因突變位點(diǎn)。

表1 katG、inhA基因片段PCR擴(kuò)增用的引物序列Table 1 Primers used to amplify fragment of katG and inhA

1.4 質(zhì)量控制 每批號(hào)試劑檢測(cè)均用H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和陰性對(duì)照隨標(biāo)本一起檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。以藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為參考，2種檢測(cè)方法的一致性分析采用kappa一致性分析，kappa值表示不同級(jí)別的一致性：0～0.20，極低的一致性；0.21～0.40，一般一致性；0.41～0.60，中等一致性；0.61～0.80，高度一致性；0.81～1，幾乎完全一致。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 涂陽痰標(biāo)本及臨床分離株耐藥MTB檢測(cè) 在41例涂陽痰標(biāo)本中，LipA檢出MTB 37例，2例陰性，2例結(jié)果無法判讀；LipA檢出的MTB株中，11株顯示突變信號(hào)，其中MDR 5株、單耐INH 3株、單耐RFP 3株。對(duì)痰凃陽標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)與鑒定，37例檢出MTB，1例檢出非結(jié)核分枝桿菌，3例無細(xì)菌生長，藥敏試驗(yàn)檢出MDR 5株、單耐INH 3株、單耐RFP 3株。2種耐藥檢測(cè)方法的結(jié)果見表2。

表2 37株MTB LipA檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果（株）Table 2 Results of LipA results and drug sensitivity test from 37 MTB samples(strains)

107株臨床分離菌中LipA檢出MTB 98株，7例陰性，2例結(jié)果無法判讀；98株MTB中，24株顯示突變信號(hào)（MDR 9株、單耐INH 12株、單耐RFP 3株），74株敏感。藥敏試驗(yàn)檢出MDR 8株，單耐INH 11株，單耐RFP 4株，敏感75株，見表3。

表3 98株MTB LipA檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果（株）Table 3 Results of lipA and drug sensitivity test from 98 MTB samples(strains)

2.2 LipA與藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較 從臨床分離株和涂陽痰標(biāo)本中均檢出MTB 135株。LipA和藥敏試驗(yàn)均檢出RFP耐藥20株。RFP耐藥株中，LipA檢出MDR 14株、單耐RFP 6株，與藥敏試驗(yàn)結(jié)果完全一致；INH耐藥株中，LipA檢出相關(guān)突變29株（包括MDR 14株、單耐INH 15株），藥敏試驗(yàn)檢出耐藥菌27株，見表4。

2種檢測(cè)方法結(jié)果不一致4株，其中各有1株LipA檢測(cè)為rpoB+inhA、inhA及katG突變株而藥敏試驗(yàn)顯示為INH敏感，1株藥敏試驗(yàn)顯示INH耐藥而LipA未檢出katG或inhA突變。2者的一致性分析，LipA檢測(cè)INH耐藥、敏感的邊際頻率分別是0.21、0.78；藥敏試驗(yàn)檢測(cè)INH耐藥、敏感的邊際頻率分別是0.20、0.80，kappa=0.969（μ=64.17，≥95%標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分位數(shù)1.96，故P＜0.05）。依據(jù)一致性強(qiáng)度的參考判斷指標(biāo)，認(rèn)為2種檢測(cè)方法結(jié)果一致性極高。

表4 LipA和藥敏試驗(yàn)檢測(cè)135株MTB的INH耐藥性（株）Table 4 INH-resistance from 135 MTB detected by LipA and drug sensitivity test(strains)

在臨床分離株中，LipA檢出3株INH耐藥相關(guān)突變，而藥敏試驗(yàn)顯示INH敏感（圖1）。進(jìn)一步采用基因測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示12號(hào)菌株katG在315位點(diǎn)發(fā)生了點(diǎn)突變， AGC＞ACC（圖2A）；13和14號(hào)株在inhA啟動(dòng)子-15位點(diǎn)存在C＞T突變（圖2B）。測(cè)序結(jié)果表明LipA檢測(cè)突變基因可信度高。

2.3 耐藥菌株基因突變類型、位點(diǎn)與頻率 2批標(biāo)本中，LipA共檢測(cè)到rpoB突變20株（14.81%），katG或inhA突變29株（21.48%）。rpoB、katG及inhA突變類型、位點(diǎn)與頻率見表5。

3 討 論

LipA是WHO新推薦應(yīng)用相對(duì)快速的耐多藥結(jié)核病診斷方法。有研究以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)用LipA檢測(cè)武漢地區(qū)MTB對(duì)RFP和INH的耐藥性，2者的kappa值分別為0.94和0.85（P＜0.05）[8]，說明LipA與藥敏試驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果顯示：LipA檢測(cè)涂陽痰標(biāo)本和臨床分離株中MTB對(duì)RFP的耐藥性與藥敏試驗(yàn)結(jié)果完全一致，對(duì)INH耐藥的檢測(cè)一致性強(qiáng)度也達(dá)到極高級(jí)（kappa=0.969），與文獻(xiàn)所報(bào)道的結(jié)核病總體人群的檢測(cè)結(jié)果一致。說明LipA對(duì)HIV/MTB雙重感染中MTB的耐藥性也具有良好的檢測(cè)效能，特別是檢測(cè)痰標(biāo)本不須要經(jīng)過分離培養(yǎng)程序，可以提高診斷速度，這對(duì)于HIV/MTB雙重感染的及時(shí)診斷和治療具有更重要意義。

在結(jié)核病總體人群中，INH耐藥株中約有34.6%～94.3%與katG 315位點(diǎn)突變相關(guān)，2.9%～21.5%在inhA啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生突變；RFP耐藥株中超過95%是在rpoB耐藥決定區(qū)發(fā)生突變[9]。例如，云南和河南省INH耐藥株中katG 315、inhA及katG 315+inhA突變的頻率是92.80%、11.20%、4.00%和73.50%、35.64%、9.20%[10-11]，徐州市、浙江省rpoB突變株中，S531L位點(diǎn)的突變頻率是61.0%和64.66%[12-13]。本研究中INH耐藥株中katG 315位點(diǎn)和inhA的突變頻率分別占82.76%和17.24%，katG 315位點(diǎn)的突變頻率與云南省相近，而inhA突變頻率遠(yuǎn)低于河南省，未見katG 315+inhA突變型；在20株 RFP耐藥菌中，全部突變均發(fā)生于rpoB耐藥決定區(qū)，其中S531L占80.00%，高于徐州市和浙江省。本研究中INH、RFP耐藥的主要基因突變型與結(jié)核病總體人群基本一致，但突變類型少于結(jié)核病總體人群，可能與樣本量少有關(guān)；其次HIV/MTB感染者抗結(jié)核治療時(shí)間一般較HIV陰性MTB感染者短，發(fā)生耐藥突變的比率也相對(duì)低；此外還可能與不同地區(qū)MTB耐藥的基因突變類型差異有關(guān)。鑒于HIV/MTB感染者M(jìn)TB耐藥性與結(jié)核病總體人群相近，當(dāng)臨床難以獲得其病原菌耐藥性診斷時(shí)，治療用藥可適當(dāng)參考當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病總體人群的耐藥參數(shù)。

本研究中有3例INH耐藥相關(guān)突變而藥敏試驗(yàn)顯示INH敏感，1例INH耐藥而未檢測(cè)到katG或inhA突變。MTB對(duì)INH產(chǎn)生耐藥與多個(gè)功能基因（如inhA、kasA、ndh、katG等）和調(diào)控因子（如mabA-inh啟動(dòng)子和oxyR-ahpC）的突變、缺失及插入有關(guān)，此外還有外排泵機(jī)制以及其他未知的機(jī)制等。LipA只是針對(duì)katG和inhA啟動(dòng)子區(qū)域的基因突變檢測(cè)INH的耐藥性，所以出現(xiàn)藥敏試驗(yàn)與基因型耐藥結(jié)果不一至的情況也可以理解。目前使用的基因測(cè)序法僅能檢測(cè)出耐藥亞群比例為20%以上的耐藥MTB，遠(yuǎn)不及表型耐藥檢測(cè)達(dá)到1%的敏感度[14]。由此推測(cè)當(dāng)耐藥亞群比例低于20%時(shí)，LipA也同樣存在漏檢的可能。

圖1 LipA檢測(cè)顯示突變信號(hào)的INH敏感標(biāo)本12為katG突變（藥敏試驗(yàn)INH敏感）；14為inhA突變（藥敏試驗(yàn)INH敏感）；13為rpoB+inhA突變（藥敏試驗(yàn)RFP耐藥而INH敏感）Figure 1 Mutation signals of INH-sensitive isolates by LipA

圖2 藥敏試驗(yàn)與LipA法檢測(cè)結(jié)果不一致菌株的測(cè)序結(jié)果katG-12株系代表第12號(hào)菌株，pinhA-13/14株系代表13和14號(hào)菌株Figure 2 Sequencing results of isolates that are inconsistent between LipA and drug sensitivity test

表5 INH和RFP耐藥突變位點(diǎn)Table 5 Mutation sites in the INH- and RFP-resistant MTB

而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在藥敏試驗(yàn)中通常耐藥性MTB的生長速率較慢，在體外培養(yǎng)中容易被生長速率快的非變異群體掩蓋[15]，導(dǎo)致耐藥株在群體中的比例變小或消失，使藥敏試驗(yàn)顯示敏感。在分子水平檢測(cè)的LipA則可以探測(cè)到被掩蓋的突變基因型，對(duì)藥敏試驗(yàn)有補(bǔ)充作用。而僅采用一種方法評(píng)價(jià)MTB耐藥特征會(huì)存在漏檢或評(píng)價(jià)不全面的可能。

對(duì)于HIV/MTB雙重感染者而言，及時(shí)治療至關(guān)重要，可先采用LipA檢測(cè)菌株對(duì)一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，隨后還是要采用藥敏試驗(yàn)進(jìn)一步診斷，以指導(dǎo)合理及正確用藥。對(duì)于具有典型耐藥相關(guān)基因（如katG和inhA）突變而暫時(shí)保持藥物敏感性的菌株，要多關(guān)注其耐藥變化，以便指導(dǎo)及時(shí)調(diào)整治療。

由于本研究樣本量有限，能觀察到的耐藥基因突變類型和位點(diǎn)相對(duì)欠缺，有待增大標(biāo)本量進(jìn)一步觀察。本研究中有7株經(jīng)培養(yǎng)初步鑒定為MTB而LipA檢測(cè)為陰性的標(biāo)本，我們未采用其他檢測(cè)方法進(jìn)一步驗(yàn)證。由于艾滋病合并結(jié)核病患者中非結(jié)核分枝桿菌感染的占比可達(dá)到40%～50%，而臨床實(shí)驗(yàn)室主要是采用選擇性培養(yǎng)的方法進(jìn)行鑒定，其結(jié)果判定受多種因素影響。因此，對(duì)于LipA檢測(cè)為陰性的菌株應(yīng)考慮采用基因芯片和測(cè)序等其他技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，LipA檢測(cè)MTB耐藥性具有高度敏感性和特異性，可以直接檢測(cè)涂陽痰標(biāo)本，適用于HIV/MTB雙重感染MTB耐藥性的快速篩查，且對(duì)藥敏試驗(yàn)診斷具有良好的補(bǔ)充作用。

志謝感謝廣西疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所覃慧芳老師、廣西龍?zhí)夺t(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室曾蓉老師對(duì)本研究的幫助