氧化三甲胺與慢性疾病關(guān)系的研究進展及測定方法概述

李春欣，朱光澤

(長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，長春 130021)

氧化三甲胺(trimetlylamine oxide,TMAO)是一種易溶于水、甲醇、乙醇等溶劑的小分子胺。人體內(nèi)TMAO主要是以卵磷脂、膽堿、肉堿等為原料，在腸道微生物菌群的作用下生成三甲胺(trimethylamine,TMA)，TMA經(jīng)過門靜脈流入肝臟，在肝臟中黃素單加氧酶的作用下活化成TMAO[1]。人體內(nèi)TMAO含量較少，其血漿濃度主要與人們的飲食習慣、腸道菌群活性及關(guān)鍵性酶的活性有關(guān)。本文主要針對TMAO與幾種常見慢性病的關(guān)系及檢測TMAO的主要方法進行綜述，以期為臨床研究提供理論參考。

1 TMAO與慢性病的關(guān)系

1.1 TMAO與心腦血管疾病

2011年，Wang等[2]研究表明，TMAO在血漿中的濃度與人體動脈粥樣硬化的形成及面積大小有關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，喂食TMAO 20周后的小鼠主動脈根部出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊，繼續(xù)喂食TMAO以提高TMAO血漿濃度后，小鼠粥樣硬化斑塊面積也隨之增加。Tang等[3]歷時3年的隊列研究檢測了4 007名受試者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMAO血漿濃度高的研究對象比TMAO血漿濃度低的研究

對象動脈粥樣硬化斑塊發(fā)病率明顯提高；冠狀動脈造影結(jié)果顯示，血漿TMAO濃度的升高與主要不良心血管事件(腦卒中和心肌梗死)風險增加有關(guān)。

進入21世紀以來，心力衰竭的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)是心腦血管疾病的主要死因。心力衰竭是由慢性炎癥及其代謝產(chǎn)物、胃腸道功能障礙、細菌失調(diào)等多種因素通過多種渠道共同引起的。一項研究把104例臨床心力衰竭患者分成TMAO<5 μmol/L和TMAO≥5 μmol/L組，結(jié)果證實TMAO血漿濃度與N末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)呈正相關(guān)，與左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)呈負相關(guān)[4]。另一項通過對720例穩(wěn)定性心絞痛患者測定血漿TMAO濃度的研究發(fā)現(xiàn)，患者空腹TMAO濃度均在5 μmol/L上下波動，且較高的血漿TMAO濃度預示患者長期死亡風險增加[5]?？紤]原因可能是血漿TMAO濃度增加改變了血管壁原有結(jié)構(gòu)和功能，增加了血管壁的通透性，促進了血管的炎癥發(fā)生，減弱了對擴血管物質(zhì)(一氧化氮等)的敏感性，進而加快患者的心力衰竭發(fā)展進程。Ufnal等[6]通過動物實驗研究證實，血漿TMAO濃度增加還可以提高體內(nèi)血管緊張素Ⅱ的縮血管效應，促進縮血管蛋白質(zhì)的合成，延長血管緊張素Ⅱ的升壓效應。這說明高水平TMAO可能與高血壓病存在一定關(guān)系，而高血壓病又是心血管疾病的重要危險因素。除此之外，有研究通過對200例冠心病患者研究證實，TMAO與慢性心房顫動(房顫)的發(fā)生風險也有關(guān)，其主要機制可能是TMAO通過調(diào)節(jié)促炎細胞因子，或通過心房重構(gòu)和心肌細胞凋亡等來誘導心房電不穩(wěn)定，造成人體自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，進而誘發(fā)房顫[7]。不僅如此，TMAO還與腦卒中等疾病有著密切關(guān)系。徐燕飛[8]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對動脈粥樣硬化性腦血管病患者(60例)及健康對照人群(30名)測定TMAO血漿濃度發(fā)現(xiàn)，后者TMAO血漿濃度顯著低于前者，表明高TMAO血漿濃度可能是腦卒中的一個重要危險因素。Zhu等[9]通過對血小板功能的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度TMAO可促進血小板的反應性增加，誘導血栓形成，考慮可能與TMAO通過增加細胞內(nèi)Ca2+的釋放來激活多種激動劑有關(guān)。結(jié)合眾多研究文獻，筆者認為TMAO導致心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的機制可能有以下幾方面。(1)TMAO改變了血管壁、腸道、肝臟、腎臟等重要器官的膽固醇代謝通路；(2)TMAO降低了膽汁酸Cyp7a1和Cyp27a1等轉(zhuǎn)運體的表達，改變了膽汁酸池的大小與構(gòu)成；(3)TMAO升高干擾了膽固醇及脂蛋白的代謝，阻礙膽固醇從肝外組織逆向轉(zhuǎn)運進肝臟；(4)TMAO升高使巨噬細胞表面的清道夫受體數(shù)量上調(diào)，并參與泡沫細胞的形成[10]；(5)TMAO損傷了血管壁的結(jié)構(gòu)和功能，促進了血小板內(nèi)Ca2+的釋放，進而活化血小板，加速血栓形成；(6)TMAO促進環(huán)氧合酶-2、白細胞介素-6、細胞間黏附分子-1等炎癥因子的表達，從而誘導NF-κB信號通路產(chǎn)生炎癥反應。

1.2 TMAO與糖尿病

Tang等[11]通過對2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2MD)患者及健康人群檢測血漿TMAO濃度及TMAO前體物質(zhì)(膽堿、甜菜堿)濃度發(fā)現(xiàn)，T2MD患者血漿TMAO濃度及膽堿等前體物質(zhì)濃度比健康人群測定值要高。其中前者TMAO血漿濃度為4.4(2.8，7.7)μmol/L，后者為3.6(2.3，5.7) μmol/L，這表明TMAO與T2MD的發(fā)生可能有關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)與患者體內(nèi)血糖水平的相關(guān)性。Shan等[12]通過對2 694名參與者評估TMAO與T2MD的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TMAO通過阻斷胰島素在細胞中的傳導通路降低了患者的葡萄糖耐量和引起高血糖癥的發(fā)生。另外，Gao等[13]研究了TMAO對高脂肪飲食喂養(yǎng)小鼠的葡萄糖耐量的影響。結(jié)果顯示，模型小鼠空腹胰島素水平升高和胰島素抵抗增強，胰島素信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因如磷脂酰肌醇3激酶r1(phosphatidylinositol 3-kinase r1,PI3Kr1)、胰島素受體底物2(insulin receptor substrate 2,IRS2)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)等及抗炎因子IL-10的mRNA水平均降低，但促炎細胞因子巨噬細胞趨化蛋白-1的mRNA表達增加，小鼠的葡萄糖耐量受損加劇。分析認為TMAO使肝臟中胰島素信號通路、糖原合成、糖異生和葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因表達增加，但降低了抑炎因子的表達。故飲食中的TMAO會加劇葡萄糖耐量受損，阻礙肝臟胰島素信號傳導途徑，并導致喂食高脂肪飲食的小鼠發(fā)生脂肪組織炎癥。筆者認為在T2MD患者中，TMAO可通過阻斷胰島素信號通路、降低細胞對胰島素的敏感性、增加促炎細胞因子的表達等方式參與T2MD的發(fā)生和發(fā)展過程。

1.3 TMAO與慢性腎臟病

TMAO相對分子質(zhì)量為75 ku，分子量較小，容易通過腎小球基底膜隨尿排出。慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)患者腸蠕動減慢、有毒物質(zhì)在腸道堆積、腸黏膜充血水腫、發(fā)生炎癥反應等都會引起腸道損傷和菌群失調(diào)[14]。而腸道損傷和菌群失調(diào)又會造成體內(nèi)TMAO增多。Vaziri等[15]通過對正常人群和CKD患者的糞便樣品進行微生物DNA的提取和測定發(fā)現(xiàn)，在CKD患者腸道中有190種微生物水平與正常人群明顯不同，提示CKD患者腸道菌群失衡嚴重。有研究采用CKD大鼠模型進行平行實驗，也得到類似的結(jié)果。另外，Ramezani等[16]在尿毒癥患者的十二指腸和空腸中發(fā)現(xiàn)大量好氧細菌和厭氧細菌，但在正常人群中沒有。腸道菌群失調(diào)會引起一系列代謝異常，包括炎癥反應、氧化應激、胰島素抵抗等。我們認為CKD腸道菌群的改變必定會影響血漿TMAO濃度，而血漿TMAO增高，又會損傷腎臟血管，促進CKD的發(fā)展。Tang等[17]通過對521例CKD患者測定空腹TMAO血漿濃度發(fā)現(xiàn)，CKD患者血漿TMAO濃度明顯高于正常人群，且較高水平的TMAO會引發(fā)腎動脈血管粥樣硬化、膠原沉積、腎組織逐漸纖維化及腎臟濾過功能受損等。當腎臟功能受損嚴重時又會進一步加重體內(nèi)TMAO濃度，形成惡性循環(huán)。Sun等[18]研究發(fā)現(xiàn)在肥胖且腎損傷動物體內(nèi)，腎損傷分子-1水平與血液中TMAO含量成正比，提示高水平TMAO可能是促進腎臟纖維化的重要危險因素?？傊?，TMAO升高可促進CKD患者發(fā)生血管炎癥反應，促進環(huán)氧合酶-2、白細胞介素-6等炎癥因子表達、提高血小板反應性、加速血栓形成等，參與CKD的發(fā)生和發(fā)展。

2 TMAO的測定方法

現(xiàn)階段測定TMAO的方法主要有比色法、離子色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)等方法。但這些方法均存在一定缺陷，不適合臨床實驗室進行大規(guī)模篩查，詳述如下。

2.1 比色法

(1)苦味酸比色法。用三氯化鈦(TiCl3)把TMAO還原成TMA，測定TMA的含量，進而換算成TMAO的含量。(2)雷氏鹽比色法。取血清樣品，用濃鹽酸下調(diào)pH，在恒溫箱中冷卻，打開蠕動泵加入雷氏鹽飽和溶液，并不斷地攪拌。然后加入含水乙醚和70%的丙酮進行溶解洗滌，在分離柱中進行分離，525 nm處測定吸光度值?；蚣尤媵斆字Z，在化學發(fā)光儀中進行檢測[19]。比色法雖然操作簡單，但容易與人體內(nèi)其他胺類物質(zhì)發(fā)生反應，靈敏度較差，測定結(jié)果常偏高，并不適合人體內(nèi)TMAO的測定[20]。

2.2 離子色譜法

離子色譜法是指用低交換容量的離子交換樹脂為固定相對TMAO進行分離，用流動相攜帶TMAO通過電導檢測器，連續(xù)監(jiān)測攜帶TMAO的流動相引起的點的變化，再按照色譜定量方法進行比對分析。孫永等[21]用4 mmo1/L硝酸 + 3%乙腈作為淋洗液測定水產(chǎn)品中TMAO含量以檢測該方法的實用性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢測在10 min內(nèi)即完成，且分離度良好、檢出限低。但由于生物樣品中常包含一些其他陽離子，如K+、Ca2+、Mg2+等，可能會影響測定結(jié)果，所以用離子交換色譜法測定生物樣品中的TMAO并非最佳方法。

2.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)靈敏度高，適用于小分子低脂肪胺類測定?，F(xiàn)階段主要包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)兩種方法。一般用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)測定生物樣品中TMAO時，需要用TiCl3作為還原劑，使TMAO轉(zhuǎn)變?yōu)門MA，再使TMA衍生化，加上生色基團等可被檢測的物質(zhì)，再進行測定。Sacher等[22]用苯磺酰胺作為生色基團測定TMA、二甲胺(dimethylamine，DMA)等化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法重復性好，靈敏度高等。Chan等[23]利用TiCl3把TMAO還原成TMA，用丙胺作為內(nèi)標物，在堿性環(huán)境中用二乙烯基苯-羧基聚二甲硅氧烷為固定相萃取劑，吸附萃取TMA，然后用色譜儀進行比對分析，最終使用內(nèi)標法算出確切含量。由此看出，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)雖靈敏度高，但步驟繁瑣，成本較高，樣品衍生過程可能使TMAO發(fā)生降解，從而影響測定結(jié)果的準確性，因此不適合臨床大規(guī)模篩查。

3 小結(jié)與展望

進入21世紀以來，隨著人們生活環(huán)境和飲食習慣的改變，慢性疾病的發(fā)病率逐年上升，對人類的威脅日益增加，已經(jīng)嚴重阻礙了社會的進步和人類的健康。TMAO作為近些年較為關(guān)注的缺血損傷標志物，對慢性疾病的預防和監(jiān)測有重要的臨床意義?，F(xiàn)階段測定TMAO的方法仍存在誤差較大或步驟繁瑣或成本較高等局限，因此不適合臨床實驗室大規(guī)模篩查。我們迫切需要一種快速、準確并適合臨床實驗室大規(guī)模篩查TMAO的方法。隨著對TMAO測定方法的逐步試驗和探索，我們希望通過調(diào)節(jié)腸道菌群來抑制TMAO的產(chǎn)生。而TMAO作為慢性疾病標志物的新希望，也會為臨床提供更科學的預防手段和治療方法。