蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾在婦科腫瘤中的研究進(jìn)展

馬春，張?chǎng)卫?，楊虎林，翟宇宏，張瑋

1解放軍第五醫(yī)院寧夏軍區(qū)門診部，銀川750021

2寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，銀川7500010

蛋白質(zhì)的氧連接N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）糖基化修飾作為真核生物內(nèi)廣泛存在的一種翻譯后修飾，受到人們的廣泛關(guān)注。了解異常糖基化修飾和腫瘤臨床表現(xiàn)的關(guān)系可能能夠揭示更多的O-GlcNAc糖基化修飾在細(xì)胞中作為營(yíng)養(yǎng)感受器的原理。同時(shí)，更有研究表明糖基化水平增高以及O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和 O-GlcNAc糖苷酶（O-GlcNAcase，OGA）表達(dá)的異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]，提示這種修飾具有特殊的生物學(xué)特性，可能是一種新型的生物標(biāo)志物。

1 O-GlcNAc糖基化修飾的研究背景

1983年，科學(xué)家純化牛奶半乳糖基轉(zhuǎn)移酶及其帶放射性標(biāo)記的供體（UDP-[3H]galactose）時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)了O-GlcNAc。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是一種高爾基糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠把帶有β1-4基基團(tuán)的半乳糖連接到N-乙酰葡萄糖胺上。與預(yù)期相反，產(chǎn)物分析顯示大多數(shù)的半乳糖標(biāo)記的細(xì)胞裂解物中有一部分被O-GlcNAc修飾[1]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OGlcNAc不僅在大鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)含量豐富，同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也廣泛存在[2]。

O-GlcNAc糖基化修飾與其他常見(jiàn)形式的蛋白質(zhì)糖基化修飾不同，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①O-GlcNAc糖基化修飾主要發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)、線粒體內(nèi)以及細(xì)胞的細(xì)胞器內(nèi)[3-6]。②O-GlcNAc糖基化修飾一般不會(huì)形成更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[7-11]。③O-GlcNAc糖基化修飾可反復(fù)在同一個(gè)蛋白質(zhì)上連接和水解糖基團(tuán)[12-17]。O-GlcNAc糖基化修飾類似于磷酸化修飾廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，但是磷酸化修飾發(fā)現(xiàn)很早，而O-GlcNAc糖基化修飾相對(duì)發(fā)現(xiàn)較晚。OGlcNAc糖基化修飾與磷酸化修飾有“陰陽(yáng)調(diào)節(jié)”的關(guān)系，其主要原因有以下幾點(diǎn)：①O-GlcNAc糖基化修飾不像磷酸化修飾這種帶電荷的修飾方式，添加或者移除一個(gè)O-GlcNAc糖基化基團(tuán)并不能改變多肽在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中的移動(dòng)速度，當(dāng)一個(gè)蛋白質(zhì)的多個(gè)位點(diǎn)被O-GlcNAc糖基化同時(shí)修飾時(shí)才可能會(huì)引起蛋白質(zhì)遷移速率的改變[18-20]。②由于細(xì)胞中含有大量的溶解酶，所以當(dāng)細(xì)胞受損傷和細(xì)胞裂解時(shí)，大量的O-GlcNAc糖基化基團(tuán)會(huì)從蛋白質(zhì)上水解下來(lái)[21]。③O-GlcNAc糖基化較難用類似質(zhì)譜分析這樣的物理手段進(jìn)行分析，因?yàn)镺GlcNAc糖基化修飾后蛋白質(zhì)會(huì)在離子化過(guò)程中發(fā)生亞化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變或者蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊。隨著科技的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)和研究O-GlcNAc糖基化修飾的能力均逐漸提高，更具有特異性的單克隆抗體被應(yīng)用在O-GlcNAc糖基化修飾研究中，同時(shí)更加先進(jìn)的質(zhì)譜分析技術(shù)也有助于O-GlcNAc糖基化修飾的研究。

2 O-GlcNAc糖基化修飾

參與O-GlcNAc糖基化修飾的酶主要有兩種：將糖基團(tuán)添加到蛋白質(zhì)上的糖基化轉(zhuǎn)移酶——OGT和將糖基團(tuán)從蛋白質(zhì)上水解下來(lái)的糖基化水解酶——OGA[1,22-27]。OGA存在2個(gè)亞型，而OGT存在3個(gè)亞型，雖然只有OGT和OGA兩個(gè)亞基來(lái)調(diào)控O-GlcNAc糖基化修飾，但是它們?nèi)匀豢梢酝瓿烧{(diào)控蛋白質(zhì)的任務(wù)，主要是通過(guò)不同的亞基與各種蛋白質(zhì)的結(jié)合完成的。

2.1 OGT

糖基化轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)DP-GlcNAc上的糖基團(tuán)添加到蛋白質(zhì)的絲氨酸/蘇氨酸上，完成糖基化修飾。OGT最早是在大鼠細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，其編碼基因位于X染色體著絲粒附近，是高度保守的蛋白質(zhì)[28-31]。目前，OGT的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，其本身不僅能夠被O-GlcNAc糖基化修飾，還能被磷酸化修飾，磷酸化修飾能夠激活OGT的活性，但是O-GlcNAc糖基化修飾對(duì)OGT的調(diào)控作用尚不清楚[32-34]。OGT的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)能夠通過(guò)磷酸化而激活酶活性，磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosinemonophosphate-activated protein kinase，AMPK）、鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅳ（calmodulin-dependent protein kinaseⅣ，CaMKⅠV）和糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）能夠調(diào)控OGT的生物學(xué)活性。重組和純化后的OGT能夠修飾已知糖基化位點(diǎn)的小肽化合物，但是當(dāng)修飾大分子蛋白質(zhì)時(shí)則需要輔助蛋白。

UDP-GlcNAc為OGT的糖基化修飾提供反應(yīng)底物，UDP-GlcNAc是一種高能核苷酸糖，正常生理情況下是由己糖胺途徑（hexosamine biosynthesis pathway，HBP）產(chǎn)生的[35]。HBP是糖代謝途徑之一，體內(nèi)有3%～5%的葡萄糖通過(guò)HBP代謝，因此當(dāng)體內(nèi)葡萄糖增多時(shí)，HBP相應(yīng)增強(qiáng)。有研究表明，可以通過(guò)調(diào)節(jié)HBP來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾水平[36]。當(dāng)OGT將UDP-GlcNAc上的GlcNAc基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上后，剩余的UDP會(huì)負(fù)反饋抑制OGT活性，由于細(xì)胞內(nèi)UDP會(huì)被很快地清除，因此OGT活性主要依賴于UDP-GlcNAc。隨著UDP-GlcNAc的增加，其酶的活性也相應(yīng)增加。同時(shí)，UDP-GlcNAc濃度高低會(huì)影響OGT對(duì)底物的催化作用，由此可以看出OGT調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能可能受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響。

2.2 OGA

OGA最早發(fā)現(xiàn)于大鼠的腎臟細(xì)胞，與MGEA5屬同源基因。OGA存在兩個(gè)亞型，其功能主要是將蛋白質(zhì)上的GlcNAc基團(tuán)水解下來(lái)，該過(guò)程動(dòng)態(tài)可逆[26]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)OGA的研究相對(duì)較少，主要集中在與OGT的共同作用機(jī)制，如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的糖基化水平，完成蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等方面。

3 蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化修飾的過(guò)程

迄今為止，很多生物細(xì)胞內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了OGlcNAc糖基化修飾，從絲狀真菌、蠕蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、植物到人類。O-GlcNAc糖基化修飾也見(jiàn)于單核細(xì)胞諸如李斯特菌內(nèi)，但目前還不清楚單核生物中OGT是否也參與了糖基化反應(yīng)。相對(duì)于其他糖基化修飾，O-GlcNAc糖基化修飾過(guò)程相對(duì)快速。淋巴細(xì)胞在有絲分裂過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白質(zhì)會(huì)迅速水解，而細(xì)胞核內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾的蛋白質(zhì)會(huì)相應(yīng)增加。有研究表明，部分藥物能夠引起蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化修飾，細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc糖基化修飾水平會(huì)受細(xì)胞應(yīng)激、細(xì)胞周期，以及胰島素通路等的影響[21]。以上結(jié)果提示，O-GlcNAc糖基化修飾類似于磷酸化修飾，也是一種翻譯后修飾過(guò)程，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生物活性。

研究發(fā)現(xiàn)，很多蛋白質(zhì)均能夠被O-GlcNAc糖基化修飾，糖基化的反應(yīng)大部分存在于細(xì)胞核內(nèi)，OGT能夠催化包括RNA聚合酶Ⅱ在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化修飾。此外，糖基化反應(yīng)也發(fā)生在細(xì)胞應(yīng)激和能量代謝過(guò)程中，線粒體中超過(guò)90多種蛋白質(zhì)存在糖基化修飾位點(diǎn)，可發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的許多骨架蛋白如actin、vinculin和talin等也會(huì)發(fā)生O-GlcNAc糖基化修飾[37-39]。α-tubulin蛋白本身也有O-GlcNAc糖基化修飾，但相對(duì)較低[40-42]。以上研究表明，目前已發(fā)現(xiàn)很多蛋白質(zhì)能夠被O-GlcNAc糖基化所修飾，O-GlcNAc糖基化修飾在完成蛋白質(zhì)翻譯后修飾、調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)功能方面發(fā)揮重要作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAc糖基化修飾和蛋白激酶反應(yīng)共用相同的絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)，糖基化修飾和蛋白激酶之間可能存在相對(duì)復(fù)雜的關(guān)系，二者共同作用完成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾[43-47]。實(shí)際上，許多磷酸化水解酶都與OGT相偶聯(lián)，在發(fā)生去磷酸化過(guò)程的同時(shí)也會(huì)發(fā)生糖基化，其中一個(gè)典型的例子就是RNA聚合酶Ⅱ的羧基末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal，CTD）重復(fù)區(qū)，該區(qū)域存在多個(gè)糖基化與磷酸化的競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)，在一些蛋白質(zhì)中磷酸化與糖基化作用位點(diǎn)相鄰，二者之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但對(duì)于某些蛋白質(zhì)而言磷酸化與糖基化之間的關(guān)系尚不明確。

4 O-GlcNAc糖基化修飾與腫瘤

4.1 O-GlcNAc糖基化修飾與婦科腫瘤

研究表明，許多與腫瘤相關(guān)的蛋白質(zhì)都存在O-GlcNAc糖基化修飾。而糖基化水平的變化通過(guò)何種途徑以及作用于哪些靶點(diǎn)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。升高子宮內(nèi)膜癌中的OGlcNAc糖基化水平能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定性，完全敲除OGT會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎纖維母細(xì)胞發(fā)育受限。有研究表明，O-GlcNAc糖基化與胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化有關(guān)。O-GLcNAc糖基化修飾在婦科腫瘤中的研究少有報(bào)道，其研究尚處于起步階段[20-49]。

4.2 O-GlcNAc糖基化修飾與其他腫瘤

研究表明，糖基化水平增高以及OGT和OGA表達(dá)的異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如乳腺癌組織中OGT和O-GlcNAc的表達(dá)量明顯高于癌旁組織[1,22,48-50]。更有研究表明，糖基化水平越高，腫瘤的惡性程度越高，可見(jiàn)于子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、肺癌、肝癌等[40-43]。還有研究表明，結(jié)腸癌中轉(zhuǎn)移灶內(nèi)OGT的表達(dá)量明顯高于原發(fā)灶[49-50]。以上研究表明，OGT和蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化水平可能與腫瘤的惡性程度有關(guān)。

5 小結(jié)與展望

O-GlcNAc糖基化修飾作為一種營(yíng)養(yǎng)感受器受體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的影響，而這一變化又能進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞的生理功能。但是OGT與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系目前尚不清楚。O-GlcNAc糖基化修飾的研究尚處于起步階段，在婦科腫瘤中鮮有報(bào)道，但隨著研究的深入，其在婦科腫瘤領(lǐng)域?qū)⒄宫F(xiàn)出廣闊的科學(xué)研究和臨床應(yīng)用前景，有望成為婦科腫瘤早期診斷、預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物及分子治療靶點(diǎn)。