雞樹條莢蒾組培再生體系的建立

摘 要：采用正交試驗設計，研究不同激素配比對雞樹條莢蒾莖段和葉片組培再生的影響，建立雞樹條莢蒾組培再生體系。結果表明：適于莖段分化的培養(yǎng)基為：WPM+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖，分化率為93.66%；適于葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)基為：WPM+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2 mg/L 2，4-D，誘導率為93.33%，添加50 mg/L 維生素C、50 mg/L 活性炭可使葉片的褐化現(xiàn)象減輕；適于生根的培養(yǎng)基為：WPM+1.5 mg/L IBA+1 g/L 活性炭，生根率為94.62%。

關鍵詞：雞樹條莢蒾；組織培養(yǎng)；快繁；植株再生

中圖分類號：Q945.51 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）04-0001-04

Abstract：By orthogonal experiments， we studied the effects of different concentration of hormone ratio on the regeneration system of stem and leaves， in order to establish the tissue culture and regeneration systems of Viburnum sargenti. The most optimal medium for differentiation

of stem was WPM+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA， the differentiation rate was 93.66%； The most optimal medium for induce callus was MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2 mg/L 2，4-D， the inducement rate was 93.33%. Adding 50 mg/L VC and 50 mg/L AC， the browning of the leaves can be reduced. The most optimal rooting medium was WPM+1.5 mg/L IBA+1 g/L AC， the rooting rate was 94.62%.

Key words：Viburnum sargenti Koehne； tissue culture； rapid propagation； plant regeneration

雞樹條莢蒾（Viburnum sargenti Koehne）為忍冬科（Caprifoliaceae）莢蒾屬（Viburnum Linn.）植物，廣布于黑龍江省小興安嶺、張廣才嶺及老爺嶺等地區(qū)[1]。

雞樹條莢蒾為落葉灌木，聚傘形花序生于枝梢頂端，球果核形，耐寒、喜濕潤，在微酸、微堿性土壤中均可正常生長[2]。雞樹條莢蒾不僅具有較高的觀賞價值，還具有很高的藥用價值，其莖中含有人體必需的脂肪酸，可用于治療類風濕性關節(jié)炎[3]，該樹種在園藝觀賞及藥用等方面都具有很高的開發(fā)利用價值。

目前雞樹條莢蒾的繁育較困難，主要以種子繁殖為主，但其種子具有深休眠特性，而扦插繁殖又存在生根率較低等問題。組織培養(yǎng)技術因具有繁殖系數(shù)高、不受季節(jié)限制、保持無性系優(yōu)良特性等優(yōu)點[4-6]，被認為是一種可在短期內(nèi)實現(xiàn)莢蒾規(guī)?；庇氖侄?。近年來，莢蒾屬植物的組培研究倍受關注，其中，香莢蒾（Viburnum farreri）[7]、地中海莢蒾（Viburnum tinus）[8]及歐洲莢蒾（Viburnum opubus L.）[9]等均已建立相應的莖段再生體系，并獲得再生植株。但有關雞樹條莢蒾的組培再生研究相對較少。為此，試驗采用正交設計，研究不同激素配比對雞樹條莢蒾莖段和葉片分化及再生的影響，建立其組培再生體系，旨在為雞樹條莢蒾的組培快繁及基因工程育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黑龍江省哈爾濱市建設銀行培訓學校校園內(nèi)成年已開花且無病蟲害的雞樹條莢蒾為試驗材料，選擇來源于同一健壯植株基部萌生的嫩枝，經(jīng)過消毒處理后進行離體快繁并獲得大量組培苗。

WPM培養(yǎng)基：400 mg/L NH4NO3、370 mg/L MgSO4·7H2O、96 mg/L CaCl2·2H2O、8.6 mg/L ZnSO4、0.25 mg/L CuSO4、27.8 mg/L FeSO4、990 mg/L K2SO4、170 mg/L KH2PO4、22.4 mg/L MnSO4、6.2 mg/L H3BO3、0.25 mg/L NaMoO2·2H2O、37.3 mg/L Na2EDTA、0.1mg/L鹽酸硫胺素、0.5 mg/L鹽酸吡哆辛、0.5 mg/L煙酸、2.0 mg/L甘氨酸、100 mg/L肌醇、25 mg/L蔗糖、5.8 mg/L瓊脂、0.01～1.0 mg/L 6-芐基腺嘌呤、0.01～1.0 mg/L吲哚丁酸、0.000 1～0.01 mg/L噻苯隆，加蒸餾水制成，pH值為5.8。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的預處理和消毒 將流水沖洗過的莖段用70%酒精消毒20 s，其間充分震蕩，使酒精與莖段表面充分接觸，取出莖段用無菌水清洗3遍；然后用3%的次氯酸鈉消毒10 min，充分震蕩使次氯酸鈉與莖段表面充分接觸，再依次用無菌水清洗3遍，最后用無菌濾紙吸干莖段表面的水分；用無菌剪刀將莖段兩端已被消毒液氧化的部分剪掉，再將剩余莖段剪成僅包含一個腋芽的小段，接種到生根培養(yǎng)基上。

1.2.2 激素種類與濃度對莖段不定芽、葉片愈傷組織誘導的影響 將帶有芽點的莖段（約2～3 cm）按1.2.1的方法消毒后垂直接種到WPM培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，其激素采用L9（34）正交試驗設計（表1），設置6-BA、IBA、蔗糖3個因素，每個因素設置3個水平，6-BA為1、2、3 mg/L，IBA為0.1、0.2、0.3 mg/L，蔗糖為10、20、30 g/L。

選取生長旺盛的葉片按1.2.1的方法消毒后剪成1 cm×1 cm大小，接種于添加50 mg/L 維生素C（VC）及50 mg/L活性炭（AC）的WPM培養(yǎng)基進行愈傷組織的誘導，其激素種類與濃度采用L9（34）正交試驗設計（表2），設置6-BA、IBA、2，4-D 3個因素，每個因素設置3個水平，6-BA為1、2、3 mg/L，IBA為0.1、0.2、0.3 mg/L，2，4-D為1、2、3 mg/L。

培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照16 h/d，光照強度2 000 Lx。每個處理接種30個外植體，重復3次，接種60 d后，統(tǒng)計莖段分化率及葉片愈傷組織的誘導率。

1.3 繼代周期對不定芽誘導的影響

將莖段垂直接種到含有2 mg/L 6-BA及0.2 mg/L IBA的WPM培養(yǎng)基上進行莖段分化培養(yǎng)，分別以20、25、30、35、40 d為繼代周期，每個處理接種30個外植體，重復3次，觀察植株長勢，培養(yǎng)60 d時，統(tǒng)計增值倍數(shù)、株高。

1.4 不同激素濃度對不定芽生根的影響

待誘導分化形成的不定芽伸長至2～3 cm時，接種于含有0、0.5、1、2、3 g/L AC，1、1.5、2 mg/L IBA或1、1.5、2 mg/L NAA的WPM培養(yǎng)基中誘導生根，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照16 h/d，光照強度2 000 Lx。每個處理接種30個外植體，設置3次重復，接種40 d后，統(tǒng)計不定芽的生根數(shù)量和株高，計算生根率。對生根組培苗進行煉苗和移栽，30 d后統(tǒng)計苗木移栽成活率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行方差分析，用Duncan檢測方法進行多重比較。

莖段不定芽分化誘導率=（分化外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

葉片愈傷組織誘導率=（獲得愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

不定芽生根率=（生根外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

增值倍數(shù)=增殖芽數(shù)/接種外植體總數(shù)

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度對莖段不定芽誘導的影響

莖段垂直接入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)15～20 d后，基部有愈傷組織形成，培養(yǎng)30 d后，出現(xiàn)不定芽，45 d左右不定芽伸長至3～4 cm（圖1）。通過比較K值（表3）可知，當6-BA濃度為2 mg/L、IBA濃度為0.2 mg/L、蔗糖濃度為20 g/L時，分化率最高，為93.66%。由極差分析（表3）可知，6-BA、IBA、蔗糖的極差分別為28.63、13.06、1.11，即：影響分化的主要因素為6-BA，其次是IBA，最后是蔗糖。在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增加，莖段分化率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。當6-BA濃度超過2 mg/L、IBA濃度超過0.2 mg/L時，不定芽伴有一定的玻璃化現(xiàn)象，說明高濃度的6-BA和IBA對不定芽的分化及生長有一定的抑制作用。由此確定雞樹條莢蒾莖段分化的培養(yǎng)基為：WPM+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖。

2.2 激素種類與濃度對葉片愈傷組織誘導影響

雞樹條莢蒾葉片分化誘導的過程見（圖2），當培養(yǎng)至21 d時，主脈及邊緣出現(xiàn)少量的愈傷組織；培養(yǎng)到35 d時主脈及葉緣全部愈傷組織化；繼續(xù)培養(yǎng)時，部分葉片組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，尚未獲得不定芽。由K值（表4）可知，當6-BA濃度為2 mg/L、IBA濃度為0.1 mg/L、2，4-D濃度為2.0 mg/L時，誘導率最高，為93.33%。由極差可知（表4），6-BA、2，4-D、IBA的極差分別為26.02、9.73、0.64，說明6-BA是葉片愈傷組織誘導的主要影響因素。當6-BA濃度超過2 mg/L時，愈傷組織結構松散，褐化現(xiàn)象更為嚴重。由此確定葉片愈傷誘導培養(yǎng)基為：WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 mg/L 2，4-D。為減輕褐化造成的毒害，在預試驗基礎上添加50 mg/L VC、50 mg/L AC，褐化現(xiàn)象明顯減輕。

2.3 繼代周期對不定芽增殖的影響

多重比較分析可知，不同繼代周期對不定芽增殖影響顯著（P<0.05），隨著繼代周期的延長，不定芽的長度呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，增值倍數(shù)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當繼代周期為35 d時，不定芽較多，莖節(jié)明顯，增值倍數(shù)最高為7.39，不定芽長度為4.14 cm；當繼代周期40 d時，不定芽生長緩慢，底部葉片變黃，培養(yǎng)基變干。由此確定雞樹條莢蒾莖段分化的繼代周期為35 d。

2.4 激素種類與濃度對不定芽生根的影響

將長度超過2.5 cm的不定芽接入生根培養(yǎng)基，多重比較結果表明（表5），IBA、NAA濃度對不定芽的生根影響顯著（P<0.05），生根數(shù)量、不定芽長度隨著激素濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當WPM培養(yǎng)基中僅添加1.5 mg/L IBA時，不定芽的生根率最高，為90.91%，平均生根數(shù)為6.24條，10 d后開始生根，培養(yǎng)20 d時，有二級根形成，根多而長，呈輻射狀生長（圖3A、C）。而僅添加1.5 mg/L NAA時，不定芽基部先形成愈傷組織再生根，生根時間較長。當同時添加2種激素時，生根數(shù)少、根短而粗。由此確定雞樹條莢蒾生根的培養(yǎng)基為：WPM+1.5 mg/L IBA。

2.5 活性炭濃度對不定芽生根的影響

經(jīng)多重比較可知，AC的添加對不定芽生根影響顯著（P<0.05），生根數(shù)、根長及株高均隨著AC添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當活性炭質量濃度為1 g/L時，生根率為94.62%，生根數(shù)為8.12條、根長為4.24 cm、株高為5.15 cm，根部呈輻射狀生長，苗木健壯綠盈（圖3B、D）；當活性炭濃度超過1 g/L時，株高、生根數(shù)、根長均下降，且葉片顏色逐漸變淺。因此，在雞樹條莢蒾生根培養(yǎng)過程中活性炭的使用濃度為1 g/L。

2.6 煉苗與移栽

選取株高5～7 cm，生長健壯、根系發(fā)達的雞樹條莢蒾再生植株進行煉苗和移栽，移栽15 d開始有新葉形成，苗木成活率達100%（圖3E）。

3 結論與討論

研究建立了高效的雞樹條莢蒾組培再生體系，對雞樹條莢蒾的保存和繁育具有重要意義，也為其規(guī)模化生產(chǎn)及基因工程育種提供了重要參考。試驗結果表明：適于莖段分化的培養(yǎng)基為：WPM+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 g/L 蔗糖，分化率為93.66%，同時以35 d為繼代周期，不定芽的增值倍數(shù)為7.39；適于葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)基為：WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+2.0 mg/L 2，4-D，愈傷組織誘導率為93.33%，愈傷組織結構致密，顏色呈淡綠色；適于生根的培養(yǎng)基為：WPM+1.5 mg/L IBA+1 g/L AC，培養(yǎng)10 d后即可生根，生根率為94.62%，經(jīng)過煉苗和移栽，成活率達到100%。

Nobre等[10]在對興山繡球（Viburnum tinus L.）研究

時發(fā)現(xiàn)6-BA濃度對不定芽增殖影響較大，當6-BA濃度過高時分化芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，說明高濃度的細胞分裂素對莖段分化不利。適宜的繼代周期對不定芽生長及增殖有一定影響，繼代周期過短，不定芽形成的數(shù)量少，繼代周期過長，培養(yǎng)基變干，影響不定芽生長。此外，以不同激素對葉片進行愈傷組織誘導，初步得到顏色淡綠、結構致密的愈傷組織，但尚未分化出不定芽，因此雞樹條莢蒾葉片的組培再生還有待進一步研究。另外，葉片在培養(yǎng)過程中容易褐化[11]，為此，在分化培養(yǎng)基中添加50 mg/L VC和50 mg/L AC，外植體褐化現(xiàn)象明顯減輕。Schoene等[12]在對香莢蒾的生根研究中加入NAA與IBA效果較好。該研究中僅添加IBA有助于雞樹條莢蒾的生根，并且在生根培養(yǎng)基中添加1 g/L AC，根長有明顯增加，利于苗木移栽和成活。

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（責任編輯：夏亞男）