抗纖靈方對阿霉素腎病大鼠腎纖維化指標(biāo)的影響

蔣宇峰，朱堯焓，陳 瀟，何立群

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院西院，上海 200021；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海 201203）

慢性腎功能衰竭（CRF）是多種慢性進(jìn)行性腎臟疾病進(jìn)展至終末期最終結(jié)果。其發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)就是腎臟纖維化表現(xiàn)，是各類腎臟疾病最后共同病理改變，包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[1-3]。我院傳統(tǒng)中藥制劑抗纖靈顆粒，經(jīng)前期20余年臨床和實驗發(fā)現(xiàn)，其具有保護腎功能，降低蛋白尿作用[4-5]。本研究通過腎切除聯(lián)合阿霉素誘導(dǎo)大鼠建立腎纖維模型，在腎功能、尿蛋白定量、細(xì)胞因子及腎臟病理組織形態(tài)多方面研究抗纖靈方治療腎臟纖維化的作用。

1 材料

1.1 動物 實驗動物均有由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（180±20）g，清潔級。所有大鼠均在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心統(tǒng)一管理，分籠SPF級喂養(yǎng)，自由飲水，用標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)。需適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，環(huán)境為45 %濕度，溫度25 ℃。

1.2 實驗藥物制備 抗纖靈方由丹參15 g，制大黃15 g，黃芪15 g，牛膝15 g，桃仁15 g，仙靈脾15 g組成。從曙光醫(yī)院西院中藥房購買上述藥材，按成人60 kg標(biāo)準(zhǔn)劑量20倍，用量為30 g/（kg·d）灌注藥物2 mL/d，抗纖靈配成為含原藥3.0 g/mL的藥液?？扑貋?.1 g/片，默沙東公司提供，灌胃前用蒸餾水配制成混懸液，用量為33 mg/（kg·d）灌注藥物2 mL/d。

1.3 試劑與儀器 腎功能檢測血清肌酐、尿素氮和尿蛋白定量，其試劑盒購自南京建成生物工程研究所，曙光醫(yī)院中心實驗室全自動生化分析分析儀測定腎功能（Bun、Cr），免疫比濁法測定24 h尿蛋白總量。Trizol Reagent RNA抽提試劑盒（Invitrogen）；熒光定量PCR試劑盒 購自BioTNT公司；由CST公司提供兔抗小鼠TGF-β一抗，由SANTA CRUZ公司提供兔抗小鼠CTGF一抗，上海威奧生物有限公司提供二抗山羊抗兔。

2 方法

2.1 造模及分組方法 取正常對照組8只大鼠予以生理鹽水灌胃，不做任何處理，作對照組；余下32只大鼠于配置好3%戊巴比妥鈉按照1.5 mL/kg腹腔注射麻醉，采用8只大鼠只切除右腎后，不注射阿霉素，作為假手術(shù)組后只予以生理鹽水灌胃。另剩余24只大鼠均采用右腎摘除加重復(fù)注射阿霉素的腎纖維化動物模型。手術(shù)組按上述麻醉后，均于右腎腎門結(jié)扎，切除右腎。術(shù)后1周后手術(shù)組大鼠尾靜脈給予注射阿霉素溶夜?jié)舛? mg/kg，常規(guī)喂養(yǎng)4周后，手術(shù)組再進(jìn)行第2次尾靜脈注射，阿霉素溶液濃度3 mg/kg。造模后2周眼球取血，根據(jù)血肌酐顯著高于正常組驗證模型成功，然后根據(jù)血肌酐值隨機分為3組，包括模型組8只、抗纖靈組8只、科素亞對照組8只，使實驗各組間大鼠血肌酐值無顯著性差異，P＞0.05。

2.2 藥物干預(yù)及標(biāo)本采集 固定動物飼料和生理鹽水分別喂以正常組、假手術(shù)組、模型組。抗纖靈組以成人劑量/kg體質(zhì)量的20倍灌胃，每日灌胃1次，科素亞組以成人劑量/kg體質(zhì)量的20倍灌胃，每日灌胃1次，連續(xù)8周后處死。手術(shù)處死前1天用代謝籠收集各組大鼠24 h尿量。按上述方法常規(guī)腹腔麻醉后，先腹主動脈采血3～5 mL后，再結(jié)扎左腎門，切除左腎，洗凈附著血液后，放入液氮保存組織標(biāo)本。抽取血液以2 000 rpm離心15 min后，取500 μL上層血清- 80 ℃保存，待今后檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 每日觀察大鼠生活情況 觀察大鼠精神狀態(tài)，活動飲食情況變化，外觀皮毛亮澤、大便性狀、體質(zhì)改變等表現(xiàn)。

2.3.2 腎功能測定 離心血清肌酐值用苦味酸法，尿素氮值用二乙酰-肟比色法，24 h尿蛋白定量值采用免疫比濁法測定。

2.3.3 腎 組 織 TGF-β、CTGF mRNA RT-qPCR 測 定表達(dá) 取大鼠腎組織，用Trizol 總試劑盒提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，進(jìn)行PCR擴增，擴增體系如下：大鼠TGF-β，CTGF及GAPDH引物序列由invitrogen 公司合成，按操作說明反應(yīng)條件95 ℃，5 min預(yù)變性；95 ℃，5 s變性，60 ℃退火30 s，40次循環(huán)，進(jìn)行數(shù)據(jù)實時擴增曲線和熔解曲線。所得Ct值以2-△△Ct計算mRNA的相對表達(dá)量。

2.3.4 腎組織病理變化觀察 大鼠左腎組織石蠟包埋，MASSON染色，顯微鏡檢測，圖像采集分析。

2.3.5 腎間質(zhì)病理損害評價方法 分別采用6項病理指標(biāo)來評價損害情況，1）腎小管擴張；2）腎小管萎縮；3）腎小管上皮細(xì)胞變性；4）腎小管上皮細(xì)胞壞死；5）腎間質(zhì)纖維化；6）腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。腎小管無病理變化，即沒有腎小管擴張、萎縮、上皮細(xì)胞變性、壞死或無炎癥，評0分；腎小管發(fā)生輕度改變占視野的20%，輕度1分；腎小管病變累及范圍占視野的21%～40%，中度評2分；病變達(dá)到腎小管范圍＞視野的40%，重度3分。該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)計算法以顯微鏡下隨機選取10個視野，按上述標(biāo)準(zhǔn)計算評分后的平均值，作為腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 正常組、假手術(shù)組大鼠精神表現(xiàn)狀態(tài)良好、自由活動、毛有亮澤，飲食正常、隨時間增長體質(zhì)量逐漸增加。尾靜脈注射阿霉素后，模型組和科素亞組分別有1只死亡。模型組和各治療組大鼠分別有精神不振、靜止待坐、不思飲食、毛發(fā)無亮澤雜亂、體質(zhì)量不增加或減輕和大便變稀等表現(xiàn)，其中以無治療模型組癥狀較抗纖靈組、科素亞組上述癥狀重，而抗纖靈組大鼠變化相對情況輕。

3.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量，血肌酐，尿素氮定量 見表1。與正常組、假手術(shù)組比較，模型組、抗纖靈組、科素亞組蛋白尿肌酐、尿素氮均有不同程度升高，以模型組改變最明顯?？估w靈和科素亞組治療后，與模型組比較，各指標(biāo)表達(dá)均有減低（P＜0.05），24 h尿蛋白定量抗纖靈組表達(dá)降低，與科素亞組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

表1 各組腎功能，尿蛋白結(jié)果比較（ ）

表1 各組腎功能，尿蛋白結(jié)果比較（ ）

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組組比較，△P＜0.05，與科素亞組比較，▲P＜0.05

組 別 n 24h尿蛋白定量/（mg/24 h） 血肌酐/（μmol/L） 血尿素氮/（mmol/ L）正常 8 15.32±2.04 65.21±4.38 8.12±4.29假手術(shù) 8 17.34±3.15 67.54±5.21 8.21±3.52模型 7 134.32±2.13# 182.31±4.67# 26.57±3.56#抗纖靈 8 43.32±4.01#△▲ 88.32±3.22#△ 15.42±5.02#△科素亞 7 65.32±3.61#△ 86.62±4.21#△ 18.53±4.31#△

3.3 各組大鼠腎組織TGF-β、CTGF mRNA水平比較 見表2。與模型組比較，抗纖靈組、科素亞組TGF-β、CTGF mRNA表達(dá)水平均有下降（P＜0.05），與科素亞組比較，TGF-β表達(dá)水平下降優(yōu)于科素亞組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腎組織 TGF-β、CTGF mRNA比較（ ）

表2 各組大鼠腎組織 TGF-β、CTGF mRNA比較（ ）

注：與模型組比較，# P＜0.05；與科素亞組比較，△P＜0.05

組 別 n TGF-β CTGF假手術(shù) 8 0.54±0.06 0.61±0.05模型 7 1.34±0.10 1.85±0.03抗纖靈 8 0.52±0.02#△ 0.84±0.02#科素亞 5 0.80±0.03# 0.83±0.03#

3.4 各組大鼠腎組織腎損傷間質(zhì)分?jǐn)?shù)比較 見表3。纖靈組和科素亞組腎損傷間質(zhì)分?jǐn)?shù)較模型組均有下降（P＜0.05），其中抗纖靈組積分下降優(yōu)于科素亞組，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腎組織腎損傷間質(zhì)分?jǐn)?shù)比較

3.5 各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)變化 模型組：腎小球局灶節(jié)段性硬化，部分腎小球新月體形成，硬化細(xì)胞數(shù)量明顯增高，基底膜厚薄不均，結(jié)構(gòu)不清。彌漫性腎小球系膜區(qū)增寬，毛細(xì)血管管腔狹窄，系膜基質(zhì)輕中度增生；腎小管上皮細(xì)胞顆粒變性，細(xì)胞壞死脫落；腎小管擴張的管腔中可見管型；中重度纖維化并炎癥細(xì)胞浸潤于腎間質(zhì)。

抗纖靈治療組與科素亞組：腎小球局灶節(jié)段性硬化程度和硬化細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯減少?；啄ぽp度增厚，小部分腎小球腫脹，小部分腎小球球性硬化，腎小球系膜區(qū)輕度增寬，系膜基質(zhì)輕度增生，腎小管管腔擴張減輕，可見少量蛋白管型和細(xì)胞崩解碎片，局灶性免疫復(fù)合物沉積。腎小球新月體少量，腎間質(zhì)有輕度纖維化，少量局灶性淋巴細(xì)胞浸潤?？估w靈組病理改善優(yōu)于科素亞組。

圖1 各組腎組織病理形態(tài)學(xué)比較（Masson染色）

4 討論

國內(nèi)外的文獻(xiàn)研究表明，慢性腎臟?。–hronic kindey disease，CKD）的發(fā)病率已經(jīng)超過10%[6-7]，各種CKD進(jìn)展至終末期腎病（End stage renal disease，ESRD）的最后病理基礎(chǔ)是腎臟硬化，即腎纖維化，造成腎小球單元功能毀損，形成臨床上的尿毒癥期。早期防止腎纖維化尤為關(guān)鍵。腎纖維化其共同病理改變就是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化（Renaliterstitialifbrosis，RIF），是導(dǎo)致腎功能喪失最主要的病理生理機制[8-9]。逆轉(zhuǎn)或減緩腎間質(zhì)纖維化的研究是當(dāng)今腎臟病研究的熱點之一，積極探索腎間質(zhì)纖維化形成的機制，了解其發(fā)生發(fā)展機制，為診斷和治療提供新的靶點和藥物。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腎臟病理變化的描述是腎間質(zhì)纖維化，根據(jù)其慢性腎臟病中代謝功能紊亂、尿少、浮腫等臨床表現(xiàn)可歸屬于祖國醫(yī)學(xué)的“水腫”“癃閉”“關(guān)格”等范疇[10]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性腎病過程中普遍存在高凝狀態(tài)，往往需抗凝治療，正好歸屬中醫(yī)“血瘀”范疇[11]。中醫(yī)的瘀范圍廣泛，由于正氣虧損，脾腎失調(diào)，濕、瘀、毒內(nèi)蘊，氣機不暢，往往需要疏血通絡(luò)治療，其對應(yīng)病理表現(xiàn)為腎小球硬化球囊黏連，腎小球內(nèi)微血栓，基底膜增厚，毛細(xì)血管腔塌陷或狹窄，血管襻擠壓閉塞等改變，即腎纖維化表現(xiàn)?？梢娀钛鍪侵委熌I纖維化理論依據(jù)之一[12-13]。

由此可見臨床抗腎纖維化治療重要手段之一就是祛除腎臟的瘀血，因此在本研究中我們研究活血化瘀抗纖靈方的抗腎纖維化作用，并探討其作用機制及靶點。該方由丹參、制大黃、黃芪、牛膝、桃仁、仙靈脾組成，該方以黃芪、仙靈脾為君藥，黃芪性微溫，功能補氣升陽、利水消腫、固表生津；仙靈脾溫腎壯陽，與黃芪二者相合，補氣健脾、溫陽補腎；方中三味臣藥為丹參、桃仁、懷牛膝，丹參主要涼血活血，散結(jié)破瘀，“一味丹參，功同四物”，桃仁功能破血行瘀，善泄血分之壅滯，牛膝性善下行，有活血通經(jīng)之能，又善補益肝腎，三藥相濟，共謀活血之理。制大黃更有活血祛瘀之功，扶正降濁，攻補兼施。

本文觀察結(jié)果顯示，抗纖靈方可明顯降低阿霉素腎病大鼠 24 h尿蛋白量，降低尿素氮、肌酐水平，改善腎組織病理變化，降低腎小管硬化指數(shù)，表明該方具有保護腎功能，抗腎纖維化作用。

腎纖維化最重要的病理變化是由于成纖維細(xì)胞的異常增生，引起系膜細(xì)胞過度增生,以致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM） 的大量堆積[14-15]。體內(nèi)有許多因子和酶參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解，使其保持動態(tài)平衡。TGF-β被認(rèn)為是最重要促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成增多的細(xì)胞因子之一[16-17]。其通過多方面促進(jìn)腎小球細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成積聚，主要是刺激細(xì)胞外基質(zhì)受體合成，使細(xì)胞黏附于細(xì)胞外基質(zhì)，同時TGF-β誘導(dǎo)多種細(xì)胞分泌結(jié)締組織生長因子（CTGF），CTGF又反饋作用于相關(guān)細(xì)胞，參與TGF-β促細(xì)胞外基質(zhì)合成作用。CTGF是TGF-β的下游因子[18]，兩者相互促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，抑制胞外基質(zhì)蛋白降解，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的活動，及細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞因子的表達(dá)分泌增加等多途徑促進(jìn)纖維化，抑制降解，因此CTGF在組織器官纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[19-20]。本實驗通過觀察TGF-β、CTGF指標(biāo)，探討從影響細(xì)胞外基質(zhì)合成降解來對腎纖維化的影響。本實驗提示阿霉素腎病模型組TGF-β、CTGF表達(dá)增高明顯，而在抗纖靈、科素亞治療后，兩者表達(dá)都明顯降低，尤其抗纖靈組，TGF-β表達(dá)下降優(yōu)于科素亞組，說明抗纖靈方對TGF-β調(diào)節(jié)有抑制作用，而使其下游因子CTGF表達(dá)受到抑制。通過腎損傷間質(zhì)分?jǐn)?shù)表達(dá)評價，抗纖靈組和科素亞組在病理學(xué)改變方面，2組均有改善腎纖維化表現(xiàn)，其中抗纖靈組改變優(yōu)于科素亞組。

此外，科素亞作為血管緊張素受體拮抗劑，還有一定的腎臟保護作用，對腎間質(zhì)纖維化也有一定的改善作用，為本實驗證明。其對腎臟保護機制可能為激活或抑制一些細(xì)胞因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?？赊卓寡芫o張素II， 誘導(dǎo)足細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子降低，提示ARB類藥物可以通過下調(diào)足細(xì)胞的表達(dá)水平，而減少蛋白尿的發(fā)生，發(fā)揮保護腎臟作用[21]，其進(jìn)一步機制有待研究來驗證。

本實驗證實抗纖靈方對阿霉素腎病大鼠模型的腎纖維化有一定改善作用，降低蛋白尿，改善腎功能具有一定的優(yōu)勢，尤其是改善腎臟病理方面更加明顯，推測作用機制可能是通過抑制TGF-β水平，從而抑制CTGF水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成途徑來實現(xiàn)的。