針灸預處理對胃黏膜損傷大鼠胃黏膜微循環(huán)相關因子一氧化氮、內皮素的影響

霍新慧，智 勇，赫吉銘，郭梓杰，馮逸杰，熱愛拉·加納提

（新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院針灸基礎教研室，烏魯木齊 830054）

隨著人們預防觀念的逐漸加強，“治未病”成為研究的熱點，針灸預處理在中醫(yī)對胃黏膜損傷“治未病”方面療效顯著[1-2]。胃黏膜損傷（Gastric mucosal lesions，GML）常見的發(fā)病原因有物理性、化學性（如飲酒、藥物）、精神性刺激，和細菌或其毒素等因素。胃黏膜損傷的臨床表現(xiàn)是一系列的程序化的損傷反應，主要表現(xiàn)為胃黏膜充血、糜爛、水腫、壞死和脫落，以及淺表性潰瘍。針灸預處理是通過適度針灸預處理相關腧穴，以發(fā)揮其扶助正氣、激發(fā)經氣的作用，并激發(fā)一系列胃黏膜自身保護機制的作用與潛力，從而發(fā)揮其防治疾病的效應。

本研究以胃黏膜損傷指數(shù)（UI）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和內皮素（endothelin，ET）的表達為指標，探討針灸預處理對胃黏膜損傷的保護作用及與NO、ET的關系，并將針預處理和灸預處理做比較，研究二者對急性胃黏膜損傷的保護作用，并探討其對胃黏膜微循環(huán)的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠40只，3～4月齡，空腹體質量（200±50）g，雌雄各半，新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（新）2016-0003，飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級實驗動物房，屏障來源證號：NO.65000700000749。飼養(yǎng)溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%，自然明暗周期，實驗期間大鼠自由飲水和進食，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗，實驗過程中動物處置方式符合動物倫理學標準。

1.2 儀器與試劑 半自動輪轉石蠟切片機（金華市科技有限公司，H3315），TG16-WS高速臺式離心機（常州市萬豐儀器制造有限公司），JJ-2組織搗碎勻漿機（常州市金壇新航儀器廠） ，lympus Bx-70 顯微成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）。ELISA試劑盒（武漢博士德生物有限公司）。

1.3 大鼠分組及處理 將大鼠編號，按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組10只。1）正常組：鼠架束縛，30 min/次，1次/d，連續(xù)7 d；2）模型組：鼠架束縛，30 min/次，1次/d，連續(xù)7 d；3）針預處理組：鼠架束縛，毫針刺中脘、足三里（雙），30 min/次，1次/d，持續(xù)7 d；4）灸預處理組：鼠架束縛，溫和灸中脘、足三里（雙），30 min/次，1次/d，持續(xù)7 d。各組大鼠每次處理后松綁，回籠正常飼養(yǎng)，連續(xù)處理7 d，第8天大鼠禁食不禁水，第9天模型組、針預處理組和灸預處理組制作急性胃黏膜損傷模型。

1.4 腧穴定位 腧穴定位依據(jù)《實驗針灸學》[3]常用動物穴位定位法確定。中脘：臍上約20 mm，足三里：取雙后肢膝關節(jié)后外側，腓骨小頭下約5 mm處。

1.5 針灸方法 大鼠固定于自制鼠架上，定穴后局部剪毛。毫針刺選用0.25 mm×13 mm的毫針（蘇州針灸用品有限公司），進針深度5 mm，平補平瀉法，每10 min行針1次（上午10: 00開始），1次/d，每次30 min，連續(xù)治療7 d。灸法選用溫和灸，將溫灸純艾條（南陽臥龍漢醫(yī)艾絨廠，規(guī)格4 mm×120 mm）固定于改良后的艾條懸灸支架上，使艾條點燃部位垂直距離大鼠穴位或者非穴對照點約2 cm，3個穴位同時施灸，30 min/次，1次/d，上午10: 00開始連續(xù)灸治7 d。1.6 模型制備 采用無水乙醇灌胃法[4-5]：各組大鼠在灸預處理7 d之后，禁食不禁水24 h后進行無水乙醇灌胃，正常組采用生理鹽水灌胃，按照每只大鼠0.6 mL/100 g無水乙醇劑量灌入相應劑量，為防止大鼠胃黏膜損傷后的自愈，1 h后按照2 mL/只阿司匹林混懸液進行灌胃，連續(xù)3 d。

1.7 指標檢測

1.7.1 胃黏膜損傷指數(shù)（UI） 末次給藥后，大鼠禁食24 h，禁水8 h，腹腔麻醉（10%水合氯醛0.35 mL/100 g）后立即剖腹， 所有大鼠摘下全胃，沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗，將胃平攤在濾紙上，用放大鏡肉眼觀察進行UI的評定。按GUTH法[6]計算：將用冰生理鹽水沖洗干凈過的胃組織在濾紙上平展開，10倍放大鏡下用直尺肉眼觀察評估：損傷≤l mm（包括糜爛點）為1分；l mm＜損傷≤2 mm為2分；2 mm＜損傷≤3 mm為3分；3 mm＜損傷≤4 mm為4分；＞4 mm為5分；損傷寬度＞2 mm者計分加倍。每只大鼠的UI 等于胃黏膜各處糜爛的計分值的和。

1.7.2 胃組織NO、ET的測定 每組隨機抽取5只胃組織稱重，將剪碎的組織塊（0.5～1 g）放入量好的冰水中（胃組織:冰生理鹽水為1:9），用組織搗碎機10 000～15 000 r / min 研磨制成10%的胃組織勻漿，4 ℃低溫（低溫低速離心機）3 000 r/min 離心15 min，取上清液，- 20 ℃低溫保存，酶免法檢測胃黏膜組織勻漿中NO、ET的含量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示。經正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者，多組計量資料比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊者用 LSD 和 SNK 法，若方差不齊者用Tamhane’s T2或 Dunnett’s T3法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察 正常組大鼠胃黏膜光滑，無充血、水腫、糜爛；模型組大鼠胃黏膜明顯充血、水腫，可見不同程度的點狀、片狀和條索樣糜爛、出血點及潰瘍形成；與模型組比較，針預處理組和灸預處理組大鼠胃黏膜損傷面積明顯減少，未見潰瘍形成，可見部分點狀出血，以及條索狀糜爛；尤其是灸預處理組損傷程度最小，偶見少許點狀糜爛，無出血及潰瘍現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)（UI）的比較 與正常組比較，模型組、針預處理組和灸預處理組的UI指數(shù)明顯升高（P＜0.01），說明造模成功；與模型組比較，針預處理組和灸預處理組UI指數(shù)明顯降低（P＜0.01），說明針灸預處理能減輕胃黏膜損傷；與針預處理組比較，灸預處理組大鼠UI指數(shù)顯著降低（P＜0.05），說明灸預處理足三里、中脘穴，相比針預處理更能顯著減輕胃黏膜損傷。

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)（UI）的比較（ ，n = 10）

表1 各組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)（UI）的比較（ ，n = 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與針預處理組比較，▲P＜0.05

組 別 UI正常組 0.66±0.69模型組 13.42±4.50##針預處理組 5.91±2.70##△△灸預處理組 3.62±2.54##△△▲

2.3 各組大鼠胃組織NO、ET的比較 與正常組比較，模型組、針預處理組和灸預處理組的胃組織NO含量明顯降低（P＜0.01），ET含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，針預處理組和灸預處理組的胃組織NO含量明顯升高（P＜0.01），ET含量明顯降低（P＜0.01）；與針預處理組比較，灸預處理組大鼠的胃組織NO含量明顯升高（P＜0.05），ET含量明顯降低（P＜0.01）。說明灸預處理能顯著改善胃黏膜血液循環(huán)，抵抗胃黏膜損傷，且灸預處理比針預處理作用更顯著。

3 討論

胃黏膜損傷是導致多種消化系統(tǒng)疾病的主要病理生理學環(huán)節(jié)，胃黏膜受到損傷因子一定程度的侵害時，可啟動自身多層次的防御體系與修復機制[7]，即胃黏膜保護[8-9]，Wallace等人將該防御機制闡述為5個層次：粘液-碳酸氫鹽-磷脂屏障、表面上皮細胞防御體系、胃黏膜微循環(huán)屏障、胃黏膜免疫細胞屏障、胃黏膜的自身修復。

表2 各組大鼠胃組織NO、ET含量的比較（ ，n = 10）

表2 各組大鼠胃組織NO、ET含量的比較（ ，n = 10）

注：與正常組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與針預處理組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

組 別 NO/（μg/g） ET/（pg/g）正常組 16.26±2.39 94.65±9.80模型組 9.17±0.68## 188.44±20.60##針預處理組 11.43±1.70##△△ 144.22±18.07##△△灸預處理組 12.85±0.64##△△▲ 113.6±13.87##△△▲▲

胃黏膜微循環(huán)屏障是一個復雜的、綜合性的調節(jié)過程，主要的調控因素有神經調節(jié)、體液調節(jié)、血管自身調節(jié)、代謝性調節(jié)、體溫調節(jié)等，血管舒張和收縮因子的失衡是其中重要因素之一。一氧化氮（nitric oxide，NO）是內源性血管舒張因子，作為一種重要的保護因子，可以有效的調節(jié)血管緊張性和內皮細胞連續(xù)性，從而擴張血管，改善胃黏膜血液循環(huán)，維持胃黏膜完整性，間接地參與調節(jié)胃的胃酸分泌，促進潰瘍愈合[10-11]。內皮素（endothelin，ET）是一種內源性損傷因子，以自分泌和旁分泌的方式作用于靶細胞上的特異性受體，ET具有強烈的收縮血管作用，在胃黏膜損傷過程中通過收縮血管和增加滲出以減少循環(huán)血量來降低胃黏膜血流，從而減弱胃黏膜防御[12-13]。

中醫(yī)根據(jù)患者臨床表現(xiàn)，將胃黏膜損傷歸為“胃脘痛”“嘈雜”“吐酸”“胃痞”等范疇，在治療中注重“養(yǎng)”而非“治”，強調“治未病”，這與現(xiàn)代醫(yī)學認為防治本病的關鍵點在于最大限度的激發(fā)胃黏膜自身保護機制的作用與潛力的思路不謀而合。

針灸作為中醫(yī)治未病的重要手段，在機體未病或疾病尚未發(fā)生之前，預先選取某些腧穴進行針灸刺激，以激發(fā)經氣，通過扶助正氣以防止疾病的發(fā)生，減輕疾病對機體的損害[14]。

大量的臨床研究已證實了針灸對胃黏膜的保護作用[5]，作為一種生理性溫熱刺激原，艾葉性“苦、溫、辛”，歸肝、脾、腎經，是治療胃病的外用效藥，灸預處理與針預處理和其他方法相比，在“治未病”，尤其是在預防胃黏膜損傷方面獨具優(yōu)勢[1-2]。研究顯示，灸法發(fā)揮對胃黏膜損傷的防治作用，是激發(fā)機體產生內源性保護物質，并啟動一系列的保護效應：抗氧化、抗炎、抑制凋亡等抗胃黏膜損傷效應，以及損傷后胃黏膜細胞增殖、重建等[15]。

足三里是足陽明胃經的合穴、胃腑下合穴，諸多古籍記載了該穴在治療脾胃病證中具有調理脾胃、補中益氣的功效，是治療胃腑病的首選腧穴，《四總穴歌》中首句即“肚腹三里留”?，F(xiàn)代大量臨床、機制研究的文獻也證實了足三里是治療消化系統(tǒng)疾病使用頻次最多的穴位，具有促進胃動力、增加胃血流量、抑制胃酸分泌，和保護胃黏膜等功效[11]。此外，足三里是全身強壯要穴之一，常用灸法以提高機體防御疾病的能力。中脘是胃之募穴，八會穴之腑會，還是手太陽、少陽、足陽明、任脈之會。本穴適當胃的中部，具有和胃健脾、疏理中氣之效。研究顯示，治療消化性潰瘍最常用的是足三里配中脘的合募配穴[16-17]，各種證型及癥狀均取此兩穴[18]，下合穴與募穴均擅于治療腑病，臨床上配伍使用可相互協(xié)調、增強療效。

本研究結果顯示，與針預處理比較，灸預處理可以明顯減輕因無水乙醇灌胃造成的急性胃黏膜損傷，上調胃黏膜組織NO、下調其ET的表達，灸預處理的效應明顯優(yōu)于針預處理。提示灸預處理對胃黏膜損傷中胃黏膜微循環(huán)相關因子NO、ET有較好的調控作用，激發(fā)了胃黏膜保護機制[19-20]。