超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜法測定茶葉中21種農藥殘留量

金莉莉，郝振霞，高貫威，柴云峰，王晨，陳紅平，魯成銀*

1. 中國農業(yè)科學院茶葉研究所 農業(yè)部茶葉產品質量安全風險評估實驗室（杭州），農業(yè)部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008；2. 中國農業(yè)科學院研究生院，北京 100081

茶葉農藥殘留一直以來是我國茶葉質量安全存在的突出問題，農藥殘留不僅危害飲用者的身體健康，同時嚴重損壞了茶葉健康飲品的形象。隨著我國茶葉質量安全監(jiān)管水平的逐步提高，農藥殘留已成為茶葉質量安全監(jiān)測的重要內容之一。最新實施的《食品安全國家標準 食品中最大農藥殘留限量》（GB 2763—2016）中[1]，將GB 2763—2014版中關于茶葉中的農藥MRL值從28項增加至48項，表明我國對茶葉農殘限量的要求正逐步提升。歐盟、日本等對茶葉中幾百種農藥制定了嚴格的限量標準，且檢測項目仍不斷增加，限量值逐年降低，對我國茶葉出口造成了貿易壁壘[2]。因此，建立茶葉中精準、高通量的農藥殘留分析技術，有助于在茶葉生產質量控制、市場準入和出口檢驗等環(huán)節(jié)中對農藥殘留進行有效的監(jiān)控，從而保障茶葉消費安全和茶產業(yè)發(fā)展安全。

茶葉中多種農藥殘留檢測通常采用氣相色譜法、液相色譜法及色譜-質譜聯(lián)用法[3]，具有靈敏度高、選擇性好等特點。我國國家標準GB/T 23204—2008和 GB 23200.13—2016中采用氣相色譜-質譜法和液相色譜-質譜法，分別提供了茶葉中519和448種農藥及相關化學品殘留量的檢測方法[4-5]。然而茶葉樣品基質復雜，含有茶多酚、色素、咖啡堿等大量干擾物質。低分辨質譜由于儀器參數(shù)優(yōu)化復雜、質譜信息不充分等缺陷，易受茶葉基質干擾，增大了茶葉多農殘分析中假陽性誤判的風險[6]。高分辨質譜通過全掃描的質譜分析方法，可以對樣品進行高通量的目標物或非目標物篩選，很大程度上減少了樣品基質的干擾[7-8]。在此基礎上，靜電場軌道阱高分辨質譜將四級桿與靜電場軌道阱相結合，一定程度上提高了高分辨質譜的定量能力[9]。目前，靜電場軌道阱高分辨質譜已廣泛運用于蔬菜、水果中的多農藥殘留分析，但在茶葉中的應用鮮有報道[9-11]。

本文針對茶葉基質的復雜性，在優(yōu)化分散固相萃取前處理方法的基礎上，利用超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-Orbitrap MS）建立茶葉中21種農藥殘留的快速篩選方法，以期為茶葉中多農殘檢測提供可靠的分析平臺。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

靜電場軌道阱高分辨質譜儀 Q-Exactive（美國Thermo Fisher公司）；Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜（美國Thermo Fisher公司）；多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；高速冷凍離心機（德國 Sigma公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

21種農藥標準品和甲霜靈-d6同位素內標（德國 Dr. Ehrenstorfer公司和上海安譜科學儀器有限公司）；乙腈、甲醇（純度98%以上），色譜級（德國Merck公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、強陽離子交換劑（SCX）（上海安譜科學儀器有限公司）；石墨化碳黑（GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、多壁碳納米管（MWCNTs）（天津博納艾爾公司）；實驗用水為去離子水。

茶葉樣品均來自農業(yè)部茶葉產品質量安全風險評估實驗室。

1.2 樣品前處理

茶葉樣品粉粹后，過200 μm篩，準確稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入100 μL 1 mg·L-1的甲霜靈-d6同位素內標溶液，渦旋1 min后靜置 30 min，加入 5 mL去離子水渦旋1 min混勻，潤濕后再加入5 mL甲醇，渦旋2 min，以 4 500 r·min-1離心 10 min；移取上清液2 mL至裝有0.4 g PSA和0.4 g SCX粉末的5 mL離心管中，渦旋1 min，以4 500 r·min-1離心 10 min；使用注射器移取凈化后的上清液，經親水PTFE針形過濾器（孔徑0.22 μm）過濾至進樣瓶中，待上機檢測。

1.3 農藥標準溶液的配制

混合標準溶液：準確稱取各農藥標準品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成1 000 mg·L-1的標準儲備液，-18℃以下貯存。采用甲醇和水（V甲醇∶V水=1∶1）稀釋至所需濃度，得到混合標準溶液。

混合標準工作液：取適量的混合標準溶液和甲霜靈-d6同位素內標溶液，配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的混合標準工作液，其中內標溶液的質量濃度均為 10 μg·L-1。

基質標準工作液：取適量的混合標準溶液和甲霜靈-d6同位素內標溶液，利用茶葉空白樣品經1.2節(jié)處理（不添加內標）得到的基質溶液，稀釋至 1 mL，配制濃度為 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-1的基質標準工作液，其中內標溶液的濃度均為10 μg·L-1。

1.4 儀器條件

UPLC色譜條件：色譜柱采用 Hypersil GOLDTMC18柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）。流動相：A相為含 0.2%甲酸的水溶液，B為乙腈。流動相梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～3 min，10%～75% B；3～4 min，75%～100% B；4～10 min，100% B；10～11 min，100%～10% B；11～14 min，10% B。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：25℃；進樣體積：3 μL；分析時間：14 min。

質譜條件：采用HESI離子化方式，正離子模式；噴霧電壓4 kV；毛細管溫度300℃；加熱器溫度 350℃；鞘氣（N2，>99%），35 mL·min-1；輔助氣體（N2，>99%），10 mL·min-1；掃描模式為 Full Scan，分辨率為 70 000 FWHM（m/z=200）；階梯標準化碰撞能量（NCEs）為 30、50、70 eV。

2 結果與分析

2.1 儀器參數(shù)的優(yōu)化

采用 500 μg·L-1的混合標準溶液，在全掃描（Full Scan）監(jiān)測模式（分辨率R=70 000）下，分析21種農藥的分子離子峰[M+H]+精確質量數(shù)，21種農藥分子離子峰精確質量數(shù)與質量數(shù)偏差見表1。質量數(shù)偏差窗口（Mass error window，MEW）是高分辨質譜定量分析的關鍵參數(shù)，MEW過大，導致碎片離子質量數(shù)偏差超出范圍，造成假陽性誤判或定量偏大；MEW過小，可能造成假陰性誤判或定量偏小。以嘧菌酯為例，在采用MEW 1×10-6、5×10-6、10×10-6條件下，1×10-6色譜峰形明顯變形，但5×10-6和10×10-6色譜峰形無明顯變化（圖1）。因此，本文選擇MEW為5×10-6。保留時間窗口（Retention time window, RTW）是影響UPLC-Orbitrap MS定量分析的另外一個關鍵參數(shù)。本文連續(xù)進樣100 μg·L-1的混合標準溶液樣品10針，21種農藥的保留時間相對標準偏差均在5%范圍。因此，本文RTW為0.05 min。

2.2 吸附劑的優(yōu)化

為了考察不同吸附劑對目標農藥標準溶液的吸附效果，分別稱取不同用量水平的吸附劑（SCX、PSA、C18和GCB用量分別為25、50、75、100 mg；MWCNTs用量分別為 5、12.5、25、37.5 mg），各加入 1 mL 50 μg·L-1的混合標準溶液。試驗結果如圖2所示，C18、GCB、MWCNTs對目標農藥吸附作用均隨用量的增加而增強，且 GCB和 MWCNTs的吸附作用最為明顯。GCB、C18、MWCNTs作為QuEChERS前處理技術中常用的分散固相吸附劑，可以有效去除基質中的色素，對提取液顏色具有較強的凈化能力[12-13]。C18吸附劑疏水性較強，在有效去除脂肪酸和色素的同時，對非極性農藥吸附作用也較強[14]。GCB對平面結構物質具有強烈的親和力，在凈化中對部分農藥組分具有一定的保留[15-16]。此外，過量的使用吸附劑也會影響目標農藥的回收率[13,17]。由圖2所知，C18在4種用量水平下，氰草津、甲氧隆、磷胺和殘殺威的回收率在85%～100%，吸附并不明顯，但有9種目標農藥的回收率在其各個用量水平下均低于72%。經25、50、75、100 mg不同用量的GCB吸附后，磷胺的回收率在63%～89%之間，其余20種農藥的回收率均在72%以下；且當用量超過50 mg時，除磷胺以外的 20種農藥回收率均在33%以下。MWCNTs用量在5 mg時，二甲草胺、滅線磷、仲丁威、呋霜靈、甲霜靈、吡草胺、異丙甲草胺、磷胺、丙草胺和殘殺威的回收率可以達到76%以上；但當MWCNTs用量在12.5 mg及以上時，21種目標農藥中僅磷胺的回收率在78%以上，其余農藥的回收率均隨用量的上升大幅減少，最少降低至 0。而SCX和 PSA對目標農藥的吸附作用并不明顯，回收率均在74%～113%之間；且隨吸附劑用量的增加，回收率變化不大。盡管C18、GCB和MWCNTs對茶葉基質的凈化效果較好，但由于其對目標農藥具有明顯的吸附作用，不適用于作為本方法的分散固相吸附劑。因而，選擇SCX和PSA對茶葉提取液的脫色效果進行對比。

表1 21種農藥的精確質量數(shù)及其質量數(shù)偏差Table1 Accurate masses and mass errors of 21 pesticides

分別稱取不同用量水平的SCX和PSA，加入l mL綠茶、紅茶提取液中，對比凈化液顏色的不同。結果顯示，SCX和PSA對茶葉基質均具有明顯的脫色效果，且隨著 SCX、PSA用量（150、200、250 mg）的增加，提取液顏色逐漸變淡。當用量為200 mg時，凈化液顏色與 250 mg用量下凈化效果差異不明顯。因此，SCX、PSA以200 mg·mL-1的用量為最佳。

基于對目標農藥的吸附作用及對茶葉基質的凈化效果，稱取SCX、PSA各200 mg，分別加入1 mL質量濃度為50 μg·L-1的綠茶、紅茶基質標準工作液中，驗證SCX-PSA混合吸附劑對茶葉基質的凈化效果。試驗結果顯示，加入混合吸附劑凈化后，基質顏色明顯變淡，呈透明顏色；除了氰草津在紅茶中的回收率為 72%，其余農藥在綠茶、紅茶中的回收率均在82%～102%之間，符合農殘檢測的要求。綜合回收率結果和對茶葉基質的凈化效果，本文選擇各200 mg·mL-1的SCX和PSA混合吸附劑作為QuEChERS方法中的吸附劑材料。

2.3 方法評價

2.3.1 基質效應

本研究采用1.3節(jié)配制的系列混合標準工作液，按照1.4節(jié)的儀器條件檢測，以峰面積對應的質量濃度繪制成標準曲線。同時，選擇空白的綠茶、紅茶樣品按1.3節(jié)配制的同樣濃度范圍的基質標準工作液，繪制標準曲線。以ME值定義基質效應，計算公式如下：

ME=[(基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率)－1]×100%。

圖1 嘧菌酯標準溶液（20 μg·L-1）在不同質量數(shù)偏差窗口（MEW）的提取離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of azoxystrobin in standard solution at 20 μg·L-1 in different mass error windows (MEW)

圖2 21種農藥標準溶液（50 μg·L-1）在不同吸附劑下的回收率Fig. 2 Recoveries of 21 pesticides in standard solution at 50 μg·L-1 with different absorbents

試驗結果由表2所示，21種農藥的 ME值為-27.0%～6.1%，基質效應表現(xiàn)并不明顯，但在各個農藥之間的基質效應差異較大。氯唑磷的基質效應為-27.0%～-14.4%，基質抑制效應表現(xiàn)最為明顯，其余農藥的基質效應均在-18.4%～6.1%范圍內?；诓煌N農藥基質效應的差異性，本文采用基質標準工作液進行定量。

綠茶（不發(fā)酵茶）和紅茶（發(fā)酵茶）之間的基質效應較為接近。21種農藥在綠茶和紅茶中的 ME值分別為-27.0%～1.8%和-18.4%～6.1%。在綠茶中，14.3%的農藥ME值在0%～10%以內，81.0%的農藥ME值在-20%～0%范圍內，僅氯唑磷農藥的基質抑制效應超過20%。在紅茶中，14.3%的農藥 ME值在0%～10%以內，其余農藥ME值均在-20%～0%

范圍內。由于21種農藥在不同種類茶葉間的基質效應差異并不明顯，大批量茶葉樣品在篩選時可選擇一種茶類的空白茶葉基質配制標準工作液進行定量分析。

表2 21種農藥在綠茶、紅茶中的基質效應、相關系數(shù)（r2）、線性范圍、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）Table 2 Matrix effects, correlationcoefficients (r2), linear ranges, limits of detection (LODs) andlimits of quantitation (LOQs) of 21 pesticides in green and black teas

表3 綠茶和紅茶樣品中的加標回收率及相對標準偏差(RSD)Table 3 Recoveries andrelative standard deviations (RSDs) of 21 pesticides in spiked greenand blackteas %

圖3 提取離子流色譜圖及質譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms and mass spectra

2.3.2 線性范圍、檢出限、回收率和精密度

采用1.3節(jié)配制的系列混合標準工作液，按照 1.4節(jié)的儀器條件檢測，以相對峰面積（A目標農藥/A內標）對應的相對質量濃度（C目標農藥/C內標）作圖，繪制標準曲線。同時，選擇空白的綠茶、紅茶樣品按1.3節(jié)配制的同樣濃度范圍的基質標準工作液，同樣以相對峰面積（A目標農藥/A內標）對應的相對質量濃度（C目標農藥/C內標）繪制標準曲線。由表2所示，在綠茶和紅茶中，21種農藥的基質標準工作液在0.5～200 μg·L-1范圍內均呈良好的線性關系，相關系數(shù)（r2）均大于0.99。

在空白綠茶和紅茶樣品中添加 21種農藥的混合標準溶液，加標水平分別為10、50、100 μg·kg-1，按照 1.2和 1.4節(jié)中的方法對樣品進行提取、凈化和檢測，回收率結果為目標農藥回收率與內標回收率比值?；厥章屎拖鄬藴势罱Y果見表3。在 10、50、100 μg·kg-13 個添加水平下，平均回收率在70%～125%之間，相對標準偏差（RSD）在0.1%～12.0%范圍內。

由于高分辨質譜的色譜圖中通常不存在背景噪音，則信噪比并不適用于定義本方法的檢出限和定量限[18]。因此，根據不同質量濃度（0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg·L-1）下基質標準工作液響應信號出現(xiàn)的最低質量濃度，將其定為檢出限，則21種農藥在茶葉中的檢出限為 0.5～2.5 μg·kg-1；根據歐盟委員會衛(wèi)生和食品安全總局（2015）的SANTE文件的指導原則，回收率在 60%～140%范圍內，且 RSD<20%的最低加標水平定為本方法的定量限[19-20]，21種農藥的定量限定為 10 μg·kg-1。

2.4 方法應用

采用本方法對浙江省市場上隨機抽取的綠茶、紅茶共40個樣品中的農藥殘留進行篩查。檢測結果顯示，7份樣品中檢出三唑磷，其中5份樣品高于檢出限但低于定量限，另外2份樣品殘留量分別為 11.1 μg·kg-1和 71.4 μg·kg-1。其余農藥在樣品中均為檢出。圖3為三唑磷紅茶基質標準工作液及三唑磷紅茶陽性樣品提取離子流色譜圖和質譜圖。

3 結論

本文在優(yōu)化了QuEChERS方法的基礎上，以甲醇和水（V甲醇∶V水=1∶1）作為提取溶劑，結合UPLC-Orbitrap MS，建立了茶葉中21種農藥殘留的快速篩選方法。高分辨質譜的使用顯著減少了茶葉樣品中的基質干擾，提高了定性定量分析的準確性。本方法簡便、快速、準確、靈敏度高，可用作茶葉中多農殘快速篩選及精確定量的檢測方法。