白茶體外抗氧化與體內(nèi)抗衰老作用的研究

曾琪，任發(fā)政,2，雷新根,3，侯彩云,2*

1. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院食品質(zhì)量安全北京實驗室，北京 100083；3. 美國康奈爾大學動物科學系，紐約 14853

白茶為中國特有，是以特定茶樹品種的鮮葉為原料，經(jīng)萎凋、干燥等生產(chǎn)工藝制成的產(chǎn)品[1]，被視為中國茶類中的特殊珍品[2]。它的加工方式與其他茶類不同，是六大茶類中加工工序最為簡單的茶類，因其制法不揉不炒，既不破壞酶的活性，也不促進酶促氧化，因此白茶被認為是原始、自然健康的茶[3]。現(xiàn)市售白茶依據(jù)茶鮮葉采摘標準不同，主要分為芽型茶白毫銀針、芽葉型茶白牡丹及貢眉和多葉型茶壽眉3個等級。

近年，白茶因獨特的滋味和良好的保健功效越來越受到人們的關注。“2012北京國際茶葉展”發(fā)布了關于白茶保健養(yǎng)生功效的研究成果[4]，結果顯示白茶具有顯著的抗衰老、保護肝臟等保健養(yǎng)生功效。目前，關于白茶的科學研究主要集中在理化成分分析[5]、抗菌[6]、抗突變[7]、抗癌[8]、預防肥胖[9]和體外抗氧化[10]等領域，而同時對白茶體外抗氧化和體內(nèi)抗衰老的研究還較少。因采摘標準的不同，不同種類白茶之間的化學成分有較大的差異，生物活性也有所不同。本研究選取不同原料來源的3種白茶——白毫銀針、白牡丹和壽眉為原料制備茶葉提取物，綜合測定其體外抗氧化活性和體內(nèi)抗衰老作用，旨在研究不同白茶提取物的抗氧化和抗衰老活性的差異，探究其作用機制，以期為白茶促進人類健康，延緩人體衰老的保健功效提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與試驗動物

2016年白毫銀針（Baihaoyinzhen, YZ）、2016年白牡丹（Baimudan, MD）、2016年壽眉（Shoumei, SM），購自北京馬連道茶城，制于福建福鼎。

DPPH（美國 Sigma公司），GSH-Px試劑盒、SOD試劑盒、T-AOC試劑盒、MDA試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），異丙醇、氯仿、無水乙醇（分析純）（北京化工），DEPC水（北京索萊寶科技有限公司），L-抗環(huán)血酸（國藥集團化學試劑有限公司），D-半乳糖（北京酷來博科技有限公司），Trizol試劑（碧云天生物技術研究所），5X All-In-One RT MasterMix試劑盒、EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye試劑盒（美國abm公司），引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

6～7周齡 SPF級雄性 ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體質(zhì)量(33±3) g，許可證號SCXK（京）2016-0011。小鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物房：溫度(22±2)℃、濕度(50±5)%、壓差20～50 Pa、12 h晝夜交替進行實驗。統(tǒng)一飼喂 SPF級小鼠生長繁殖的飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號京飼證(2014)06054。

1.2 儀器與設備

萬能粉碎機，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，SHZ-III循環(huán)水真空泵，RE-52AA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空冷凍干燥機，Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白檢測儀，Nikon Eclipse Ci光學顯微鏡，Biometra T-personal梯度PCR儀，Roche lightcycler 96熒光定量PCR儀，Eppendorf 54180R低溫超速離心機，LX-200掌式離心機，F(xiàn)A2004分析天平，TU-1810紫外可見分光光度計等。

1.3 方法

1.3.1 白茶提取物制備與理化成分測定

將3種白茶分別均勻混合后，用萬能粉碎機將少量試樣磨碎過40目篩備用。參考保健食品功能學評價程序與檢驗方法規(guī)范中對動物實驗受試物的制備方法[11]，按照 1∶15茶水比，80～90℃水浴浸提1 h，過濾并重復上述操作1次，合并茶湯進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥48 h得到白茶提取物。

分別采用福林酚法[12]測定茶多酚含量，三氯化鋁比色法[13]測定總黃酮含量，紫外分光光度法[14]測定咖啡堿含量。

1.3.2 體外抗氧化活性測定

DPPH自由基清除法：參照 Ramadan[15]方法并稍加修改，配制 0.2 mmol·L-1的 DPPH無水乙醇溶液，于4℃下避光保存?zhèn)溆?，按?所示，將各管混勻，于室溫黑暗處放置 30 min，在517 nm的波長下測定吸光值。DPPH清除率的計算公式：

式中：A樣品為樣品管吸光度；A空白為空白管吸光度；A對照為對照管吸光度。

表1 DPPH法加樣表Table 1 The method of DPPH addition mL

T-AOC試劑盒法：按照試劑盒說明書的簡便操作表，配制混合試劑，分別對各白茶提取物的總抗氧化能力進行測定。

1.3.3 動物實驗設計

白茶劑量設計：茶葉的人體每日推薦劑量為0.15 g·kg-1[16]，參照保健食品功能學評價程序與檢驗方法規(guī)范，選擇人體推薦量的10倍、30倍為小鼠的低、高白茶攝入劑量，即分別為 1.5、4.5 g·kg-1·d-1。

實驗動物分組：90只小鼠按體重隨機分為 9組，每組 10只，分別為：正常對照組（NC）、模型對照組（MC）、陽性對照組（PC）、白毫銀針提取物高劑量干預組（YZH）、白毫銀針提取物低劑量干預組（YZL）、白牡丹提取物高劑量干預組（MDH）、白牡丹提取物低劑量干預組（MDL）、壽眉提取物高劑量干預組（SMH）、壽眉提取物低劑量干預組（SML）。除 NC組小鼠皮下注射等體積生理鹽水外，其他各組皮下注射D-半乳糖150 mg·kg-1；造模同時給予灌胃干預，NC和MC組灌胃等體積蒸餾水，PC 組灌胃 100 mg·kg-1·d-1等體積 VC，其余組別小鼠灌胃白茶原茶對應等量的白茶提取物，持續(xù)處理56 d。

1.3.4 樣本采集及處理

實驗結束后所有小鼠禁食12 h，摘眼球取血，斷頸法快速處死。所得血樣于3 500 r·min-1離心15 min，分離血清樣本；切取一葉肝臟迅速凍存于-80℃以待下一步的生化檢測，切取另一葉肝臟暫存于組織固定液中，用于組織病理學觀察。

1.3.5 生化指標的檢測

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）水平利用全自動生化分析儀測定；血清和肝組織的SOD、GSH-Px活性、T-AOC水平和MDA含量按照試劑盒說明書方法測定。

1.3.6 組織病理學觀察

從組織固定液中取出肝組織，脫水，石蠟包埋，制片（4 μm厚），HE染色，光學顯微鏡觀察并在200倍視野下拍照。

1.3.7 實時熒光定量PCR檢測

Trizol試劑抽提小鼠肝臟RNA，檢測RNA濃度及質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈，熒光定量采用 10 μL體系，EvaGreen 2X qPCR MasterMix-No Dye 5 μL，cDNA 模板 1 μL，上游引物（10 nmol·L-1）0.3 μL，下游引物（10 nmol·L-1） 0.3 μL，ddH2O 補充至 10 μL。按照梯度程序：95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，60 s，循環(huán)35次。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用法[17]對各抗衰老相關基因的表達水平進行分析。

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、核因子 E2-相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）和 Klotho基因引物由上海生工合成，其序列如表2所示。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以均值±標準誤差表示；組間均值比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 白茶提取物的主要功效成分

3種白茶提取物中茶多酚、總黃酮和咖啡堿含量如表3所示。從表中可以看出，YZ提取物的茶多酚含量極顯著高于MD和SM提取物（P＜0.01），YZ和 SM 提取物的總黃酮含量極顯著高于 MD提取物（P＜0.01），YZ和MD提取物的咖啡堿含量極顯著高于SM提取物（P＜0.01）。YZ提取物的3種主要功效成分含量均為最高，SM提取物的茶多酚和總黃酮含量均高于MD提取物。

茶多酚是影響茶葉滋味、色澤的重要品質(zhì)成分，是茶葉中多酚類化合物的統(tǒng)稱，以兒茶素含量居多[18]，兒茶素具有很強的抗氧化活性，可以清除機體內(nèi)的自由基，是一種天然抗氧化劑[19]。此外，茶葉中的黃酮類化合物也具有很強的清除自由基能力，抗氧化效果良好[20]。有研究表明，白茶中的黃酮類物質(zhì)高于其他茶類[21]，可能與其鮮葉種類和加工方式有關?？Х葔A是茶葉中苦味的主要呈味物質(zhì)，除具有強心、興奮、利尿等藥理功效外，還具有抗癌的作用[22]，是茶葉中重要的生物活性物質(zhì)之一，可能與茶葉中其他生物活性成分存在協(xié)同作用，起到間接抗氧化的作用。

表3 白茶提取物的主要功效成分Table 3 The main efficacy components of white tea extracts mg·g-1

2.2 白茶提取物的體外抗氧化活性

如圖1-A所示，3種白茶提取物對DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而升高，當質(zhì)量濃度為 40 μg·mL-1時，YZ提取物對 DPPH自由基的清除率超過90%，MD和SM提取物均超過85%。3種白茶提取物均表現(xiàn)出較強清除DPPH自由基的能力，其中，YZ提取物最強，MD與SM提取物差異不明顯。

AOC是評價物質(zhì)總抗氧化能力的重要指標，其T-AOC水平越高，抗氧化能力越強。圖1-B顯示，3種白茶提取物的T-AOC水平隨濃度的增加而升高。當提取物質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1時，YZ提取物、MD提取物和 SM 提取物的T-AOC水平分別為2.68、2.25、2.15 U·mL-1。

結合表3可知，3種功效成分含量均較高的YZ提取物，清除DPPH自由基的能力和總抗氧化能力也較強。SM提取物的茶多酚和總黃酮含量高于 MD提取物，咖啡堿含量低于MD提取物。茶多酚和總黃酮具有較強的抗氧化作用，SM和MD提取物之間的體外抗氧化活性差異卻不明顯。由此可見，茶葉中的生物活性成分在起抗氧化作用時存在協(xié)同作用。

2.3 白茶提取物的體內(nèi)抗衰老作用

2.3.1 對小鼠血清SOD、GSH-Px活性、T-AOC水平和MDA含量的影響

如表4所示，MC組小鼠的血清中的SOD、GSH-Px活性和 T-AOC水平顯著低于 NC組（P＜0.05），MDA 濃度顯著高于 NC組（P＜0.05），由此可見，D-半乳糖致小鼠衰老模型制備成功。各白茶提取物組小鼠血清的SOD活性均高于MC組，其中YZL組、MDH組、SMH組顯著高于MC組（P＜0.05），SML組極顯著高于 MC組（P＜0.01）。YZH組、YZL組、MDH組、MDL組和SMH組小鼠血清的GSH-Px活性也均高于 MC組。SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活力的提高可間接反映機體清除自由基能力的增強，削弱對脂質(zhì)過氧化作用的損傷，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[23]。各白茶提取物組小鼠血清SOD和GSH-Px活性的提高，表明各白茶提取物通過提高小鼠的抗氧化酶活性進而達到清除體內(nèi)自由基，緩解機體氧化應激水平的作用。

圖1 白茶提取物的體外抗氧化活性Fig. 1 The in vitro antioxidant activities of white tea extracts

通過持續(xù)給小鼠注射一定劑量D-半乳糖，使細胞內(nèi)半乳糖濃度增高，生成半乳糖醇不能被細胞進一步代謝而堆積在細胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導致細胞腫脹和功能障礙；另外，D-半乳糖受半乳糖合成酶的作用，代謝過程中產(chǎn)生過多自由基，最終引起衰老[24]。白茶提取物通過提高小鼠血清 T-AOC水平來抑制衰老的發(fā)生，其中YZH組、MDH組、SMH組和SML組極顯著高于MC組（P＜0.01）。研究表明，MDA是氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物[25]，其濃度的變化可間接反映組織中氧自由基濃度的變化量，是常用的膜脂過氧化指標。各白茶提取物組小鼠血清MDA含量均顯著低于MC組（P＜0.05），由此可見，白茶提取物通過提高血清總抗氧化能力，降低脂質(zhì)過氧化程度來保護機體免受氧化損傷，延緩衰老的發(fā)生。

實驗結果表明，3種白茶提取物均可一定程度緩解衰老小鼠的氧化應激水平，并且未表現(xiàn)出劑量依賴性。其中，SM提取物在提高小鼠血清SOD活性和T-AOC水平方面比YZ和MD提取物更具優(yōu)勢。

2.3.2 對小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性、T-AOC水平和MDA含量的影響

表5顯示，MC組小鼠肝臟MDA含量極顯著高于NC組（P＜0.01），表明造模使小鼠肝臟發(fā)生嚴重的脂質(zhì)過氧化，使小鼠肝臟的總抗氧化能力下降。除YZH組外，各白茶提取物組小鼠肝臟SOD和GSH-Px活性均顯著高于 MC組（分別為P＜0.01，P＜0.05）。SOD和GSH-Px是肝臟中重要的抗氧化酶，能夠有效清除超氧陰離子自由基[26]、特異性地催化谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應[27]。各白茶提取物組小鼠肝臟T-AOC水平也均高于MC組，其中YZH組、YZL組、MDH組、MDL組、SMH組和SML組分別比MC組小鼠高出50%、89%、64%、64%、103%和61%，SMH組效果更為明顯。由此可見，3種白茶提取物均可提高衰老小鼠肝臟抗氧化酶的活性和總抗氧化能力，緩解衰老小鼠肝臟的氧化應激狀態(tài)。

小鼠肝臟MDA含量越高，表明小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化程度越嚴重。YZ和 SM提取物均可降低衰老小鼠肝臟MDA含量，其中YZH組和 SMH組小鼠 MDA含量顯著低于 MC組（P＜0.05），YZL組極顯著低于MC組（P＜0.01），表明YZ和SM提取物在降低小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化程度方面較MD提取物更具優(yōu)勢。

表4 白茶提取物對小鼠血清SOD、GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC的影響Table 4 Effect of white tea extracts on the activities of SOD, GSH-Px and the contents of MDA and T-AOC in serum of mice

表5 白茶提取物對小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性、MDA含量和T-AOC的影響Table 5 Effect of white tea extracts on the activities of SOD, GSH-Px and the contents of MDA and T-AOC in liver of mice

綜上可知，3種白茶提取物均可顯著提高衰老小鼠肝臟抗氧化酶的活性（P＜0.05），能夠一定程度提高其總抗氧化能力，并且未表現(xiàn)出劑量依賴性。其中YZ提取物在降低衰老小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，SM提取物效果次之，MD提取物效果相對較弱。

2.3.3 對小鼠肝組織相關基因表達的影響

肝臟SOD和GSH-Px的正常表達能控制機體內(nèi)自由基保持在較低水平，有利于機體健康。由圖2-A可知，與NC組小鼠相比，YZH組、MDH組和SMH組小鼠肝臟SOD表達分別提高了17%、64%和16%。與MC組小鼠相比，YZH組、YZL組、MDH組、MDL組、SMH組和SML組小鼠肝臟SOD表達量分別提高了252%、214%、385%、220%、248%和155%。其中，MDH組小鼠肝臟SOD的表達量顯著高于MC組（P＜0.05）。由圖2-B可知，與MC組小鼠相比，YZH組、YZL組、MDH組、MDL組、SMH組和 SML組小鼠肝臟GSH-Px表達量分別提高了 306%、210%、372%、248%、361%和 297%。結果顯示，3種白茶提取物均能上調(diào)衰老小鼠肝臟SOD和GSH-Px的表達量，并且表現(xiàn)出劑量依賴性，可通過上調(diào)抗氧化酶基因的表達來緩解機體氧化應激水平以抵抗機體衰老。

圖2 白茶提取物對小鼠肝臟SOD、GSH-Px、Nrf2和Klotho基因表達的影響Fig. 2 Effects of white tea extracts on the expression levels of SOD, GSH-Px, Nrf2, and Klotho genes in mice liver

Nrf2是抗氧化信號通路中關鍵的轉(zhuǎn)錄因子，當機體處于氧化應激狀態(tài)時，它會上調(diào)多種抗氧化酶基因的表達進而提升機體的抗氧化能力，緩解機體氧化應激，延緩衰老的發(fā)生[28]。由圖2-C可知，各白茶提取物組小鼠肝臟Nrf2的表達與提取物劑量呈現(xiàn)出劑量依賴關系。與MC組小鼠相比，YZH組、YZL組、MDH組、MDL組和SMH組小鼠肝臟Nrf2的表達均顯著提高（P＜0.05），SML組也提高了17%。與 NC組小鼠相比，YZH組小鼠肝臟Nrf2的表達也顯著提高（P＜0.05）。由此可見，YZ提取物在提高衰老小鼠肝臟Nrf2的表達方面具有明顯優(yōu)勢。

Klotho基因被稱為抗衰老基因，是哺乳動物體內(nèi)第一個過表達延長生命、低表達加速衰老的衰老抑制基因，在抗衰老及衰老相關疾病的發(fā)生中發(fā)揮著極為重要的作用[29]。由圖2-D可知，各白茶提取物組小鼠肝臟Klotho表達與MC組和NC組沒有顯著性差異（P＞0.05）。但與MC組小鼠相比，YZH組、YZL組、MDH組、MDL組、SMH組和 SML組小鼠肝臟Klotho表達分別提高了36%、54%、54%、40%、114%和49%。結果表明，YZ、MD和SM提取物均可在一定程度上提高衰老小鼠肝臟Klotho的表達，以延緩機體衰老。

2.4 白茶提取物的安全性評價

2.4.1 白茶提取物對小鼠肝組織形態(tài)的影響

圖3為各組小鼠肝臟病理學切片的 H&E染色結果，NC組小鼠肝細胞大小均勻，排列整齊，肝竇清晰，肝索排列整齊有序，細胞核清晰可見，胞漿均勻。與NC組小鼠肝臟切片相比，MC組小鼠肝臟組織出現(xiàn)了可見出血性壞死，中央靜脈周圍肝細胞胞漿疏松，肝竇內(nèi)實質(zhì)細胞增多等現(xiàn)象。由此可見，造模對MC組小鼠肝臟組織結構造成了一定程度的損傷。

圖3 小鼠肝臟組織切片F(xiàn)ig. 3 Liver tissue slice in mice

此外，其余各白茶提取物組小鼠也出現(xiàn)了不同程度的肝細胞腫脹、胞漿疏松和胞漿淡染等現(xiàn)象，但較MC組小鼠而言，各白茶提取物組小鼠肝組織損傷情況有了一定程度的減輕，但不能抑制肝臟結構的損傷，結合表6可知，各組小鼠血清肝酶與 NC組無顯著性差異（P＞0.05）。由此表明，在該實驗設置劑量下的白茶提取物對小鼠肝臟起到了一定程度的保護作用，并且未表現(xiàn)出肝毒性作用。

2.4.2 白茶提取物對小鼠血清肝酶水平的影響

血液中ALT和AST水平是評價肝臟功能正常與否的重要指標之一，也是肝細胞受損的重要指標之一[30]，由表6可知，MC組與NC組小鼠血清 ALT和 AST水平無顯著性差異（P＞0.05），表明注射D-半乳糖制備衰老小鼠模型未對小鼠肝臟造成功能性損傷。

各白茶提取物組小鼠血清ALT和AST水平與NC組小鼠沒有顯著性差異（P＞0.05），與MC組相比，YZL組、YZH組、MDH組、MDL組和SML組小鼠血清ALT水平顯著降低，YZH組和MDH組小鼠血清AST水平也顯著降低（P＜0.05），表明3種白茶提取物對小鼠肝功能有一定的保護作用。由此可見，在該實驗設置劑量下，3種白茶提取物對小鼠均未表現(xiàn)出肝毒性作用。

表6 小鼠血清ALT、AST水平Table 6 The contents of ALT and AST in serum of mice U·L-1

3 結論

本研究結果表明，3種白茶表現(xiàn)出良好的體外抗氧化作用。在相同濃度條件下，3種主要功效成分含量較高的白毫銀針抗氧化作用明顯強于白牡丹和壽眉，白牡丹與壽眉的體外抗氧化作用差別不明顯。在本實驗設置灌胃劑量下，不同白茶在機體內(nèi)發(fā)揮抗衰老作用的方式各有側(cè)重，白毫銀針在抑制小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化方面具有明顯優(yōu)勢，壽眉在提高小鼠血清抗氧化酶活性方面具有明顯優(yōu)勢。3種白茶均能上調(diào)小鼠肝組織SOD、GSH-Px、Nrf2和Klotho的表達，并表現(xiàn)出劑量依賴性，能有效改善機體氧化應激狀態(tài)，拮抗機體衰老。綜合體外抗氧化與體內(nèi)抗衰老結果，本研究所選白毫銀針的效果優(yōu)于壽眉，白牡丹的效果相對較弱。

機體衰老是一個復雜的生理過程，體外抗氧化能力越強并不意味著體內(nèi)抗衰老作用越好，而茶葉的抗衰老作用也受多種因素綜合影響，不同物質(zhì)對機體抗衰老調(diào)控方式有所不同，對于茶葉體內(nèi)抗衰老作用機制還有待進一步研究。