分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定不同茶類中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯殘留

諸力，陳紅平，柴云峰，馬桂岑，郝振霞，王晨，劉新，魯成銀

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（杭州），農(nóng)業(yè)部茶葉質(zhì)量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008

蕓苔素內(nèi)酯（Brassinolide）是一種高活性內(nèi)源植物生長調(diào)節(jié)劑（Plant Growth Regulators,PGRs），最早從油菜素甾醇類化合物（Brassinosteroids，BRs）中分離得到，屬于內(nèi)酯型甾體化合物[1]。由于其在天然植物內(nèi)含量極低且提取工藝復雜，無法滿足實際生產(chǎn)需求，因此人工合成蕓苔素內(nèi)酯成為趨勢。目前在我國已登記的4種合成蕓苔素內(nèi)酯中，2,4-表蕓苔素內(nèi)酯（2,4-Epibrassinolide，天豐素）以其合成效率高、成本低而應用最為廣泛[2]。一直以來蕓苔素內(nèi)酯普遍應用于茶園生產(chǎn)領(lǐng)域，有研究表明其通過調(diào)節(jié)茶樹葉綠素及某些內(nèi)源激素水平，能有效提升光合作用能力、促進細胞分裂，從而達到提高百芽重、增加產(chǎn)量及改善品質(zhì)的目的[3-4]。然而隨著蕓苔素內(nèi)酯等植物生長調(diào)節(jié)劑類農(nóng)藥用量增多及使用范圍日益擴大，其安全性越來越受到關(guān)注，相關(guān)文獻報道指出，不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑均具有生殖毒性[5]，部分還能夠增加腫瘤風險[6]和影響心肌功能[7]等。

目前，2,4-表蕓苔素內(nèi)酯主要檢測方法包括液相色譜法[8-9]和質(zhì)譜法[10-12]等，但絕大部分方法都需要經(jīng)過傳統(tǒng)固相萃取、濃縮、衍生等，存在操作步驟繁瑣、抗干擾差、成本高等缺點。特別是茶葉具有典型基質(zhì)效應[13-14]，其檢測前處理技術(shù)尤為關(guān)鍵，迄今尚未發(fā)現(xiàn)測定茶葉中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯相關(guān)研究報道。本文通過分散固相萃取前處理，省去濃縮、衍生等步驟，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測定不同茶類中 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯的方法。該法靈敏、高效、穩(wěn)定，可滿足各類茶葉檢測需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

茶葉樣品購置于浙江省各大茶葉市場。

標準樣品及試劑：2,4-表蕓苔素內(nèi)酯（2,4-Epibrassinolide，CAS：78821-43-9 ）（純度不低于95.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Thermo Fisher Scientific公司）；甲酸銨（99.9%）、甲酸（95%）（德國Sigma公司）。C18鍵合鋯膠（Z-sep+）（美國Supelco公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、強陰離子交換劑（SAX）、強陽離子交換劑（SCX）（美國安捷倫科技有限公司）；C18、石墨化碳黑（GCB）（天津博納艾爾杰公司）。

儀器：AB Sciex TQ 5500型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Sciex公司）；LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Mill-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）；T10高速均質(zhì)儀（德國IKA公司）；高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

茶葉樣品粉碎后過200 μm篩，稱取2.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩 1 min，18 000 r·min-1均質(zhì)提取 2 min，10 000 r·min-1低溫離心 10 min（5℃），取上清液 1 mL 至裝有 100 mg C18、25 mg SAX和25 mg GCB吸附劑的2 mL離心管中，渦旋 1 min，10 000 r·min-1離心 5 min，上清液過 0.22 μm有機系濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：含相同體積分數(shù)0.1%甲酸及1 mmol·L-1甲酸銨水溶液（流動相A）和甲醇溶液（流動相 B）；梯度洗脫程序：0～0.5 min，10%B；0.5～2 min，10%～98%B；2～5.5 min，98%B；5.5～5.51 min，98%～10%B；5.51～7 min，10%B；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：10.0 μL；柱溫：40℃；運行時間：7 min。

離子源：電噴霧離子源（ESI）正離子模式，溫度500 ℃，電壓 5 500 V；霧化氣（GS1）壓力：334.7 kPa；輔助氣（GS2）壓力：334.7 kPa；氣簾氣（Curtian Gas）壓力：241.3 kPa。定性、定量母子離子、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)見表1。

表1 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 Mass spectrometric conditions for 2,4-epibrassinolide determination

1.2.3 標準曲線制作

稱取標準樣品0.05 g，用乙腈溶解并轉(zhuǎn)移至 50 mL容量瓶定容，配制成 1 000 mg·L-1標準溶液，4℃下冷藏保存待用。

標準曲線配制：不同茶樣空白樣品經(jīng)1.2.1步驟處理后得到空白提取液，分別配制7個不同質(zhì)量濃度 0.8、4、8、40、80、400、800 μg·L-1基質(zhì)標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜和色譜條件優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度 0.5 mg·L-1的 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯乙腈標準溶液經(jīng)針泵注射進樣，在電噴霧正離子MRM模式下進行質(zhì)譜測定條件優(yōu)化，使目標化合物分子離子響應值達到最佳。通過Q1全掃模式得到化合物準分子離子峰[M+H]+m/z為 481.4，以其作為母離子進行二級裂解后得到4個靈敏度較高的碎片離子m/z分別為445.4、427.4、349.4、315.4。雖然母離子在丟失2個H2O（481.4→445.4）后得到的碎片離子的m/z為445.4時靈敏度最高，但在同等色譜條件下其信噪比（S/N）不及 m/z為 315.4的，因此選取m/z為481.4→315.4作為定量離子對。分子結(jié)構(gòu)及碎片離子裂解途徑如圖1所示。

本研究采用的可編程多反應監(jiān)測（Scheduled multiple reaction monitoring，SMRM）與較傳統(tǒng)MRM模式相比極大提高了單位檢測通量，可有效改善峰型，提高精密度和重現(xiàn)性[15]。

分別選用3種色譜柱（HSS T3，BEH C18，BEH C8）進行色譜條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)目標化合物在HSS T3柱上保留色譜峰型更佳且雜質(zhì)干擾較小。流動相優(yōu)化包括甲醇-水、甲醇-水（0.1%甲酸和 1 mmol·L-1甲酸銨）、甲醇-水（1 mmol·L-1甲酸銨）。結(jié)果表明，采用甲醇-水（0.1%甲酸和 1 mmol·L-1甲酸銨）作為流動相中的甲酸可提高[M+H]+化合物離子化效率，且緩沖體系可進一步增加系統(tǒng)穩(wěn)定性[16]，故流動相采用甲醇-水（0.1%甲酸和1 mmol·L-1甲酸銨）。圖2給出8 μg·L-1綠茶基質(zhì)標準溶液（A）、空白綠茶樣品溶液（B）、添標 40 μg·kg-1綠茶樣品溶液（C）中 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯二級質(zhì)譜總離子流色譜圖。

2.2 前處理條件優(yōu)化

分別選擇甲醇、乙腈[17]、乙腈/水（90/10、80/20、70/30、60/40、50/50，V/V）、乙腈/甲酸溶液（99/1，V/V）以及乙腈/水/甲酸溶液（80/19/1，V/V/V）進行提取效率優(yōu)化。結(jié)果表明，隨著溶劑提取中含水比率越高，提取效果越不理想。原因可能是茶葉中強極性雜質(zhì)共溶出導致產(chǎn)生較強基質(zhì)效應（Matrix effect,Me）使離子化效率降低，從而導致質(zhì)譜信號靈敏度下降。乙腈較甲醇極性更小，利于極性相對較弱的2,4-表蕓苔素內(nèi)酯溶解。另外在提取過程中添加甲酸會導致提取效率下降9.5%，因此本研究選取乙腈作為提取溶劑。

圖1 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯的ESI質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及碎片離子裂解途徑Fig. 1 ESI mass spectrum, structure and fragmentation pathway of product ions of 2,4-epibrassinolide

圖2 8 μg·L-1綠茶基質(zhì)標準溶液（A）、空白綠茶樣品溶液（B）、添標 40 μg·kg-1綠茶樣品溶液（C）中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯二級質(zhì)譜總離子流圖Fig. 2 MS/MS total ions chromatogram of 2,4-epibrassinolide in 8 μg·L-1 matrix standard solution(A),blank solution(B) and 40 μg·kg-1 concentration levels(C) of green tea

凈化吸附劑條件優(yōu)化，分別稱取25、50、100、200 mg的 6種吸附劑（PSA、SAX、SCX、C18、GCB、Z-sep+），各加入 1 mL質(zhì)量濃度為100 μg·L-1基質(zhì)標準溶液。凈化效果由R值表示，公式為%100/0×=SSR，其中S0為凈化前基質(zhì)標樣峰面積，S為凈化后峰面積，R值越高表示經(jīng)凈化后化合物信號越強，被吸附率越低，凈化效果越理想。試驗結(jié)果如圖3所示，PSA、SCX、Z-sep+對目標化合物產(chǎn)生較強吸附作用，R值偏低；SAX和GCB在低劑量時R值較高，而隨著劑量增大R值降低；C18具有強疏水特性，對脂肪酸等弱極性化合物具有較強吸附作用，在100 mg用量時R值達到最佳。因此本研究選擇100 mg C18、25 mg SAX和 25 mg GCB作為吸附劑凈化效果最佳，樣品經(jīng)前處理后呈淺黃色透明狀。

2.3 線性范圍和方法定量限

采用1.2.3節(jié)中制備的各濃度基質(zhì)標準溶液按優(yōu)化后條件測定，以定量離子對峰面積對應濃度做標準曲線，得到不同茶類的茶基質(zhì)中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯線性方程及其相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明（表2），綠茶、紅茶、白茶、黑茶、烏龍茶基質(zhì)中，該化合物在 0.8～800 μg·L-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好（R2＞0.999）。以信噪比（S/N）計算方法定量限（LOQ，S/N=10）為 0.55～1.46 μg·kg-1。

2.4 回收率和精密度

取不同茶葉 2 g，分別添加 20、40、200 μg·kg-1標準樣品，按照前述方法處理平行測定6次，回收率和精密度詳見表2。不同茶類茶基質(zhì)中目標化合物添標回收率范圍在75.5%～93.6%之間，RSD（n=6）值范圍在0.4%～7.0%之間，表明所建方法重復性良好。

2.5 基質(zhì)效應評價

根據(jù)相應濃度乙腈溶劑標準樣品進行基質(zhì)效應評價[18]，計算公式為：

圖3 不同吸附劑對2,4-表蕓苔素內(nèi)酯吸附效果比較Fig. 3 Adsorption ability of different sorbents for 2,4-epibrassinolide with different levels

表2 不同茶類基質(zhì)中2,4-表蕓苔素內(nèi)酯線性方程、相關(guān)系數(shù)、添標回收率、精密度和方法定量限（n=6）Table 2 Linear equations, correlation coefficients, average recoveries, relative standard deviation (RSD), and limit of quantification(LOQ) of 2,4-epibrassinolide in different matrix(n=6)

kmatrix為基質(zhì)標準曲線斜率，為乙腈溶劑標準曲線斜率。

結(jié)果表明不同茶類茶葉中化合物基質(zhì)效應范圍在-16.4%～4.2%之間。為消除基質(zhì)效應干擾，試驗采用相應基質(zhì)匹配標樣進行校準。

2.6 實際樣品分析

運用此方法對市場78份樣品進行測試，所有茶樣均未檢出2,4-表蕓苔素內(nèi)酯。

3 結(jié)論

本研究建立了適用于不同茶類中 2,4-表蕓苔素內(nèi)酯測定的分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。本方法簡便快捷，靈敏精密，為我國茶葉行業(yè)中制定相關(guān)檢測標準提供了理論依據(jù)。