從湖北青磚茶渥堆過程中分離真菌總狀枝毛霉菌的鑒定與模擬發(fā)酵研究

王春燕，肖長義,2*，李世剛,2，涂璇，何建剛

1. 湖北長盛川青磚茶研究所，湖北 宜昌 443000；2. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，湖北 宜昌443002；3. 三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002

湖北青磚茶是一種黑茶，以曬青毛茶為原料，經(jīng)過渥堆發(fā)酵、陳化、蒸壓、烘干等工序精制而成的后發(fā)酵茶。根據(jù)前人的研究可知，青磚茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵是渥堆發(fā)酵工序，在發(fā)酵過程中，以微生物的活動為中心，以毛茶為基質(zhì)，在濕熱條件多種微生物的共同作用下，茶葉內(nèi)含成分發(fā)生系列氧化、縮合、降解、聚合反應(yīng)，從而形成青磚茶獨特的紅黃湯色，陳香，醇和滋味等品質(zhì)特征[1]。但是由于青磚茶產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)封閉，基礎(chǔ)研究相對滯后，青磚茶的發(fā)酵機(jī)理仍然未能完全明了，生產(chǎn)方式仍然延續(xù)傳統(tǒng)方法，產(chǎn)業(yè)升級仍然沒能實現(xiàn)重大突破，茶磚品質(zhì)穩(wěn)定性和安全性仍然難以得到有效保障。

為此，本試驗擬對取自渥堆發(fā)酵茶堆中的真菌進(jìn)行分離、鑒定，以期探明參與發(fā)酵的真菌的種類及其種屬特征，為探究真菌在茶堆發(fā)酵過程中的具體作用奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步利用真菌用于青磚茶生產(chǎn)提供基礎(chǔ)保障。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵茶葉

采集鑫鼎生物科技有限公司青磚茶發(fā)酵堆，選取良好的渥堆中布滿菌絲的茶葉，用于分離菌株。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏酵母瓊脂培養(yǎng)基，麥芽汁葡萄糖培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）。核酸抽提試劑盒、核酸染色[生工生物工程（上海）股份有限公司]，瓊脂糖凝膠。

1.3 菌株分離純化

取發(fā)酵堆茶葉少許于300 mL無菌水中振蕩，取懸液配成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各 10 mL，取 10-3、10-4、10-53 個梯度各 0.1 mL用PDA培養(yǎng)基涂布平板，超凈臺上吹干，將平板置于25℃培養(yǎng)7 d，每個梯度重復(fù)3次，挑取不同類型的真菌單菌落于PDA平板上進(jìn)一步純化培養(yǎng)，對分離得到的菌株分別命名為LC-1，LC-2，LC-3等。本試驗選取 LC-2進(jìn)行下一步研究。

1.4 真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

1.4.1 菌落特征

參照《中國真菌志》中對真菌形態(tài)描述辦法，將菌株LC-2分別接種于查氏瓊脂、查氏酵母瓊脂和麥芽汁培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察，并且分別放置于25℃、28℃、37℃環(huán)境中培養(yǎng)3 d，分別觀察菌株的生長情況。生長情況描述包括菌落直徑、顏色、菌落形狀等[2]。

1.4.2 菌株顯微形態(tài)觀察

菌株LC-2在PDA平板上培養(yǎng)，用接種環(huán)挑取少量菌體，置載玻片的水滴中，乳酸棉蘭染色，加蓋蓋玻片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。參照《真菌鑒定手冊》《真菌的形態(tài)和分類》進(jìn)行形態(tài)比對[3-4]。

1.4.3 掃描電鏡形態(tài)學(xué)觀察

取生長良好菌落的菌體，置 2.5%戊二醛中進(jìn)行固定，24 h后置換入70%乙醇中備檢。將保存的菌體置于銅載物臺上，在干燥箱中60℃烘干，置于真空鍍膜儀中鍍膜，用JSM-7401F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察，照相。

1.4.4 菌體培養(yǎng)與DNA提取

將保存在 PDA固體培養(yǎng)基上的菌株 LC-2轉(zhuǎn)接到PDA液態(tài)培養(yǎng)基中，于28℃ 180 r·min-1培養(yǎng) 3 d，過濾后收集菌絲。用核酸抽提試劑盒提取菌株DNA，并于1.0%的瓊脂糖凝膠上檢測DNA的質(zhì)量與濃度。獲得的基因組序列放置于-20℃冰箱保存[5]。

1.5 真菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 ITS序列擴(kuò)增測序與分析

基于 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析方法一直被廣泛應(yīng)用于真菌鑒定[6-8]，本試驗菌株LC-2的系統(tǒng)發(fā)育分析借鑒于此。利用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增nrDNA ITS區(qū)域。ITS序列擴(kuò)增引物為 ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′； ITS4 ：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。引物由華大基因公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系含DNA模板 0.5 μL、10×Taq 酶緩沖液 2.5 μL、5 mol·L-1dNTP 2 μL、ITS1 和 ITS4 引物各 2 μL、EX Taq酶 0.5 μL，加 ddH2O至 25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 40 s，進(jìn)行 30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果。

PCR產(chǎn)物純化后送華大基因測序，每個擴(kuò)增條帶均進(jìn)行正、反向測定。將兩端序列進(jìn)行拼接和手動矯正后，在NCBI上進(jìn)行同源性比對。

1.5.2 LSUrDNA序列擴(kuò)增測序與分析

菌株LC-2基于LSUrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析方法參照蘇經(jīng)遷等的方法[9]。利用真菌通用引物 NL1和 NL4進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 28 S nrDNA D1區(qū)域。LSUrDNA序列擴(kuò)增引物為NL1：5′-GCATATCAATAAGCGG-3′；NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。引物合成、PCR擴(kuò)增與測定方式均與 ITS序列測定與分析方法一致。

1.5.3 真菌同源性比較、遺傳進(jìn)化分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制

以菌株ITS序列和LSUrDNA擴(kuò)增序列為目的序列，在GeneBank中用BLAST程序搜索同源序列，挑選與菌株序列相近的參考序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。運(yùn)用 MEGA 5.0中的ClustalW程序?qū)λx序列進(jìn)行排列，并用鄰接法（NJ）對排列結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。將真菌ITS序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，獲得GenBank登錄號。

1.6 小鼠急性毒理試驗

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗》中限量法對菌株LC-2的毒性進(jìn)行檢測，取清潔級昆明小鼠40只（由三峽大學(xué)動物中心提供），體重18～22 g，雌雄各半，分為兩組。將菌株LC-2培養(yǎng)物制成凍干粉，用超純水制成合適濃度并滅活，按 10 g·kg-1的劑量給小鼠灌胃，對照組灌入水，以口腔灌胃形式一次性給予每只 1 mL，飼養(yǎng) 14 d，其間對小鼠進(jìn)行活體觀察，14 d后進(jìn)行眼球取血，制血涂片，wight端特化染色后鏡檢。脫頸處死小鼠，取其心、肝、脾、肺、腎5臟器于甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色后鏡檢。

1.7 固態(tài)模擬發(fā)酵試驗

取 5 kg四級曬青毛茶原料，灑水至含水量達(dá) 35%，人工接種菌株 LC-2，接種量為每公斤茶接種20萬個真菌孢子，發(fā)酵環(huán)境溫度設(shè)置為 28℃，濕度 90%，發(fā)酵時間 11 d。發(fā)酵期間每天檢測茶樣溫度，香氣和顏色變化情況。于發(fā)酵過程中，取茶葉表面包裹的菌體，置載玻片以乳酸棉蘭染色，加蓋玻片，放于光學(xué)顯微鏡下觀察，鑒定菌株類型。發(fā)酵結(jié)束后，取茶樣與用傳統(tǒng)方式發(fā)酵生產(chǎn)的青磚茶進(jìn)行感官審評，對比不同發(fā)酵方式制作的青磚茶品質(zhì)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)鑒定

真菌菌株LC-2在查氏瓊脂（CA）平板上培養(yǎng)5 d，25℃環(huán)境下，直徑約17 mm，菌落正反面均為白色，色淺，質(zhì)地絨狀；28℃環(huán)境下，直徑約20 mm，菌落色淺，呈白色，有絨狀氣生菌絲；37℃環(huán)境下，菌株不生長，圖1顯示菌株生長第3天狀態(tài)。

菌株LC-2在查氏酵母瓊脂（CYA）平板上培養(yǎng)5 d，25℃環(huán)境下，直徑約61 mm，菌落正反面均為白色，質(zhì)地絨狀；28℃環(huán)境下，直徑約56 mm，菌落正反均呈白色，具大量絨狀氣生菌絲；37℃環(huán)境下，菌株不生長，圖2顯示菌株生長第3天狀態(tài)。

菌株LC-2在麥芽汁瓊脂（MEA）上培養(yǎng)5 d，25℃環(huán)境下，直徑約 22 mm，菌落正反面均為白色，具大量絨狀氣生菌絲；28℃環(huán)境下，直徑約14 mm，菌落色淺，呈白色，無絨狀氣生菌絲；37℃環(huán)境下，菌株不生長[2]，圖3顯示菌株生長第3天狀態(tài)。

圖1 菌株LC-2在查氏瓊脂培養(yǎng)基上分別置于不同溫度環(huán)境中的生長情況（3d）Fig. 1 The colony growth of strain LC-2 on Czapek agar at different temperature for 3 days

2.2 光鏡下形態(tài)鑒定

菌株 LC-2形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖4，菌叢較矮，絨狀，菌絲細(xì)且軟弱，幼菌叢白色，菌苔先呈白色后變?yōu)榛疑螯S褐色至褐色，37℃下幾乎不生長。

菌體絲狀有隔膜，每個隔斷中有一個核，無假根，氣生菌絲中含大量形成厚垣孢子，無性階段的孢子為不動的孢囊孢子或與分生孢子相似的孢子囊，孢子囊出現(xiàn)很早，內(nèi)含孢子數(shù)量少，隨著孢子囊生長，孢囊孢子逐漸增多，孢囊體積也隨之增大。孢子囊呈球狀，壁薄易破裂，孢囊孢子由孢子囊壁破裂后釋放出來，孢囊孢子呈球形，光滑，數(shù)量大。孢囊孢子釋放后，可見囊軸，無囊托，囊軸球形至卵圓形，孢子囊中無軸基。孢囊梗呈單軸狀分枝，分枝不規(guī)則，分枝頂端著球形孢子囊。無匍匐菌絲生出，所生孢子囊不做分枝拳曲，無分枝的手指狀凸起。未觀察到結(jié)合孢子，不形成子實體。

參考《真菌鑒定手冊》與分子鑒定結(jié)果，初步將菌株 LC-2鑒定為毛霉屬（Mucor racemosus）菌株，命名為毛霉菌 LC-2菌株[3-4]。

2.3 掃描電鏡下形態(tài)鑒定

菌絲菌體全部呈倒伏狀。由于脫水的原因，全部菌絲和孢子梗均呈扁薄的條帶狀，條帶菲薄，條帶的寬窄差異大，約5～20 μm。成熟的孢子囊大，呈球形。囊壁外表面不光滑，有密集排列的帶基座的棘刺樣突起，大小均勻，刺長約 0.5 μm。當(dāng)孢子囊成熟破裂釋放出孢子時，囊壁外表面的棘刺樣突起會發(fā)生脫落。孢子囊壁十分菲薄，內(nèi)壁表面光滑，分生孢子呈球形；表面光滑，直徑約 5～6 μm。由于失水的原因，孢子全部呈皺縮干癟狀態(tài)。孢子梗在

圖2 菌株LC-2在查氏酵母瓊脂培養(yǎng)基上分別置于不同溫度環(huán)境中的生長情況（3d）Fig. 2 The colony growth of strain LC-2 on Czapek yeast extract agar at different temperature for 3 days

圖3 菌株LC-2在麥芽汁培養(yǎng)基上分別置于不同溫度環(huán)境中的生長情況（3 d）Fig. 3 The colony growth of strain LC-2 on Malt extract agar at different temperature for 3 days

圖4 菌株LC-2光鏡觀察圖像Fig. 4 The images of strain LC-2 by light microscopic examination

圖5 菌株LC-2掃描電鏡觀察圖像Fig. 5 The electron microscope images of strain LC-2

孢囊接近成熟時期，表面也有許多顆粒樣突起，顯得十分粗糙，待孢囊釋放出孢子后，表面會變得光滑，呈樹皮樣條紋。菌絲呈葦桿樣，表面光滑，很少刺樣突起（圖5）。

2.4 分子鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增獲得ITS片段和LSUrDNA片段（圖6），純化后進(jìn)行測序，測得兩基因片段大小分別為659 bp和566 bp，同源性比對結(jié)果分別如下：菌株 ITS序列與毛霉屬總狀枝毛霉（Mucor racemosus）和卷枝毛霉（Mucor circinelloides）、毛霉菌（Mucor plumbeus）、刺囊毛霉（Mucor spinosus）具有最高同源性，達(dá)99%。

菌株LSUrDNA序列與毛霉屬總狀枝毛霉（Mucor racemosus）和根毛霉（Rhizomucor racemosus）同源性最高，達(dá)100%；與毛霉菌（Mucor plumbeus）、刺狀毛霉菌（Mucor spinosus）同源性達(dá)99%。

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明（圖7和圖8），菌株 ITS序列與總狀枝毛霉菌和卷枝毛霉在同一分枝上，LSUrDNA片段與總狀枝毛霉在同一分枝，自檢支持率達(dá)90%，表明菌株LC-2與總狀枝毛霉菌遺傳距離最近。

2.5 急性毒理結(jié)果

試驗結(jié)束時小鼠未見死亡，試驗期間，小鼠的體重、營養(yǎng)狀況，精神狀態(tài)及活動與正常對照組相比未見任何異常。解剖觀察，小鼠各臟器均未見腫大或其他明顯病變，各臟器切片經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察，均未發(fā)現(xiàn)任何病變情況。血液涂片檢測未見血細(xì)胞形態(tài)及白細(xì)胞分類計數(shù)異常。

圖6 菌株LC-2 ITS序列和LSUrDNA序列電泳圖Fig. 6 Agarose electrophoresis of ITS and LSUrDNA sequences from strain LC-2

圖7 基于菌株LC-2 ITS序列構(gòu)建的NJ樹Fig. 7 Phylogenetic tree of the ITS sequences of strain LC-2 and other species using NJ method

圖8 基于菌株LC-2 LSUrDNA序列構(gòu)建的NJ樹Fig. 8 Phylogenetic tree of the LSUrDNA sequences of strain LC-2 and other species using NJ method

表1 用菌株LC-2發(fā)酵茶與傳統(tǒng)青磚茶感官審評結(jié)果Table 1 Sensory comparison of traditional green brick tea and the simulate fermentation tea with strain LC-2

2.6 固態(tài)模擬發(fā)酵結(jié)果

選用4級毛茶為材料，參照青磚茶自然發(fā)酵過程進(jìn)行模擬發(fā)酵試驗。發(fā)酵過程中可見茶樣由墨綠色逐漸變暗變褐，香氣由青氣逐漸轉(zhuǎn)化為酵香，后略有酸辛味，最終為醇香帶甜香。翻堆發(fā)現(xiàn)，茶堆表面各底部有大量白色菌絲包裹茶葉，并有褐色茶汁溢出，于茶葉上呈水珠狀。在發(fā)酵過程中對茶葉表面白色菌體進(jìn)行光學(xué)顯微鏡下鑒定，其形態(tài)與所接種的菌株形態(tài)一致，為LC-2菌株。

對利用毛霉菌菌株LC-2發(fā)酵茶與傳統(tǒng)發(fā)酵青磚茶的品質(zhì)進(jìn)行對比評價，感官分析結(jié)果表明：人工接種真菌LC-2固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的青磚茶與傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的青磚茶相比，湯色紅黃明亮、香氣甜香，滋味甜醇較濃，感官品質(zhì)特點與傳統(tǒng)產(chǎn)品接近（表1）。

3 討論

同一菌株在不同培養(yǎng)環(huán)境中，由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分各異，培養(yǎng)物的形態(tài)特征及生理生化特點會有所不同[10]。本研究依據(jù)齊祖同[2]的分析鑒定方法，通過在查氏瓊脂（CA）、查氏酵母（CYA）和麥芽汁瓊脂（MEA）培養(yǎng)基上，對毛霉菌LC-2進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，真菌LC-2在3種培養(yǎng)基上都能夠生長，菌株形態(tài)與總狀枝毛霉菌（Mucor racemosus）最為相似。結(jié)合ITS序列和 LSUrDNA序列共同比對結(jié)果，菌株LC-2的 ITS序列與總狀枝毛霉（Mucorracemosus）同源性為 99%，LSUrDNA序列與總狀枝毛霉（Mucor racemosus）高達(dá)100%，因此，該菌株被認(rèn)定為總狀枝毛霉菌。本研究從菌種形態(tài)和分子鑒定方面對菌株進(jìn)行了描述和鑒定，接下來還會探索菌株的生理生化特征，檢測菌株的特征指紋圖譜，為后續(xù)菌株的工業(yè)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

菌株LC-2已經(jīng)完成了在NCBI網(wǎng)站上的基因注冊，注冊編號為KY37220.1，菌株送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）進(jìn)行保藏，保藏編號為M2017241。本研究從青磚茶分離出總狀枝毛霉菌，并提交該菌株基因序列，豐富了該菌株生長來源和應(yīng)用途徑。

在不同環(huán)境下培養(yǎng)菌株的結(jié)果顯示，毛霉菌LC-2最適宜的培養(yǎng)基質(zhì)為查氏酵母瓊脂，環(huán)境溫度為25℃。在28℃培養(yǎng)環(huán)境中，菌株LC-2生長受到影響，在37℃環(huán)境中不生長，說明該菌株不耐高溫。因此，在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中，該菌株不會在堆溫較高的中心持續(xù)發(fā)揮作用。應(yīng)該在發(fā)酵起始階段，該菌株分布在茶堆靠近中心的起始位置，以后隨著堆溫升高，逐漸向茶堆外部轉(zhuǎn)移，在發(fā)酵中后期主要分布在茶堆表面和底部，這與模擬發(fā)酵所觀察到的現(xiàn)象一致。在該真菌分布茶堆區(qū)域中茶葉色澤轉(zhuǎn)化明顯，是否該菌富集區(qū)域茶葉色澤轉(zhuǎn)化更加充分，需要進(jìn)一步研究確認(rèn)，該菌株在茶堆發(fā)酵過程中的具體作用也需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

對分離得到的菌株進(jìn)行生物安全性測試，綜合小鼠在試驗期間的行為、臟器切片觀察結(jié)果，菌株LC-2凍干粉對小鼠沒有危害作用。說明該菌株具有良好的生物安全性，可以利用該菌株進(jìn)行青磚茶的安全生產(chǎn)。

黑茶發(fā)酵過程離不開微生物的參與[11-14]，我們用平板梯度稀釋法分離也獲得了 LC-1、LC-3等菌株，印證了前期其他學(xué)者的相關(guān)結(jié)論，黑茶發(fā)酵是一個由多菌種類協(xié)同作用的過程[11]。本研究選取分離菌株之一進(jìn)行鑒定試驗，后續(xù)也會依次對其他菌株進(jìn)行鑒定分析。本研究模擬的發(fā)酵結(jié)果，口味并未完全達(dá)到青磚茶生產(chǎn)渥堆發(fā)酵后的效果，說明青磚茶發(fā)酵過程復(fù)雜，單一菌株發(fā)酵難以達(dá)到青磚茶的轉(zhuǎn)化效果。但是，利用單個菌株進(jìn)行青磚茶固態(tài)發(fā)酵的結(jié)果表明，發(fā)酵茶能夠保持青磚茶的基本風(fēng)味，湯色紅黃，香氣略甜，滋味醇和綿軟，且發(fā)酵周期大大縮短，提高了生產(chǎn)效率。這些結(jié)果證實毛霉菌LC-2確實可以參與到青磚茶的發(fā)酵程序中，是青磚茶發(fā)酵生產(chǎn)的原生菌之一。在本研究的基礎(chǔ)上，下一步工作將進(jìn)一步探究人工固態(tài)發(fā)酵青磚茶與傳統(tǒng)青磚茶內(nèi)質(zhì)成分差異，并從內(nèi)質(zhì)變化差異角度評價該菌株在發(fā)酵過程中的地位作用，為實現(xiàn)青磚茶清潔化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。