茶葉籽乳桿菌的分離鑒定及其發(fā)酵作用特性研究

姜金仲，楊鵬鳴，王自布，穆安德，王興春

1. 貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018；2. 貴州元亨山茶葉籽生物科技有限公司，貴州 貴陽 550018；3. 河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003

茶葉籽油是以茶樹（Camellia sinensis）的種子為原料生產(chǎn)的食用油，因其含多種生物活性成分而被譽(yù)為東方橄欖油。茶葉籽油生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝[1]是近年來報(bào)道的一種茶葉籽油生產(chǎn)新工藝。該工藝的核心技術(shù)是“茶葉籽水漿發(fā)酵分層”[2]；“茶葉籽水漿發(fā)酵分層”是指茶葉籽水漿（用茶葉籽仁加水粉碎過濾后的濾液）在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)微生物發(fā)酵可以分為上、中、下3層；上層為茶葉籽油脂體，取出用于生產(chǎn)茶葉籽毛油；中層為發(fā)酵液，用于生產(chǎn)茶皂素；底層為淀粉，用于生產(chǎn)茶葉籽淀粉；因此，茶葉籽油生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝可以用茶葉籽同時(shí)生產(chǎn)3種產(chǎn)品，大大提高了茶葉籽資源的利用率[3]。同時(shí)，由于是以茶葉籽油脂體為原料生產(chǎn)茶葉籽油，最大程度避免了茶葉籽其他構(gòu)成成分對茶葉籽毛油的污染，簡化了茶葉籽毛油的精煉程序，從而提高了茶葉籽油中天然活性成分的含量，改善了茶葉籽油的營養(yǎng)品質(zhì)。茶葉籽油生物發(fā)酵生產(chǎn)工藝還能使成品茶葉籽油產(chǎn)量比壓榨工藝提高15%～25%以上。

既然發(fā)酵分層現(xiàn)象是由發(fā)酵引起的，發(fā)酵液中就必然存在發(fā)酵微生物。姜金仲等[4]首先從發(fā)酵液中分離出了茶葉籽酵母，并對該酵母的發(fā)酵作用特性進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，茶葉籽酵母數(shù)量在發(fā)酵5 h后開始減少，10 h時(shí)已基本消失；但此時(shí)茶葉籽水漿還在繼續(xù)發(fā)酵，說明此后有其他微生物替代了茶葉籽酵母繼續(xù)發(fā)揮作用；為了證明其他微生物的存在，本文對發(fā)酵 5 h后的茶葉籽水漿發(fā)酵液進(jìn)行了微生物分離鑒定，以期為優(yōu)化茶葉籽油發(fā)酵工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

茶葉籽仁：由貴州元亨山茶葉籽生物科技有限公司提供，土炕烘干帶內(nèi)種皮茶葉籽仁；用于生產(chǎn)茶葉籽仁的茶樹種子主要摘自湖北省隨州市，品種為福鼎大白茶，茶葉籽仁含水率8.4%、含油率（索氏抽提法）26.2%。

主要試劑：石油醚（德州潤昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、蛋白胨及瓊脂（安琪酵母有限公司）、牛肉膏（德州潤昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、酵母膏（廣州市昕迪實(shí)驗(yàn)器材有限公司）、K2HPO4（佛山市順德區(qū)魏瑪化工有限公司）、NaOAc（北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）。主要儀器：XSP-9CA光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器一廠）、PHSJ-4A pH計(jì)（西安禾普生物科技有限公司）、GL124-1SCN電子天平（季爾國際貿(mào)易（上海）有限公司）、TG16-WS高速離心機(jī)（濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司）、ET-7打漿機(jī)（湖北武漢宏旭機(jī)械設(shè)備責(zé)任有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉籽水漿發(fā)酵液的制備

稱取茶葉籽仁 100 g，加無菌水 300 g于35℃條件下浸泡16 h，將浸泡好的茶葉籽清洗后加無菌水300 g進(jìn)行兩輪打漿、過濾得濾液（茶葉籽水漿），將濾液置于35℃恒溫發(fā)酵[2]，約5 h后，濾液開始明顯分為上、中、下3層，備用。

1.2.2 植物乳桿菌的分離純化

在茶葉籽水漿發(fā)酵進(jìn)行到5 h時(shí)，從發(fā)酵液中層的中間位置取樣，在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)[5]，培養(yǎng)溫度 25℃；長出菌落后，挑選獨(dú)立的菌落，用接種針挑取樣本放在載玻片上，用甲苯胺藍(lán)染液染色[6]，觀察是否有是類似乳桿菌的細(xì)胞，如果有類似乳桿菌的細(xì)胞，則接種擴(kuò)大繁殖該菌落，再進(jìn)行鑒定繁殖，反復(fù)4次，得到1株類似乳桿菌的細(xì)胞純種，編號為JJZ21。

1.2.3 JJZ21菌株的鑒定

按照鑒定手冊[7]中的方法對JJZ21菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及鑒定。包括：菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)的觀察；繁殖特性及假菌絲的觀察等；顯微鏡60倍鏡下觀察拍照。

16 S rDNA及pheS序列測定、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[8]：16 S rDNA及pheS的序列測定、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測中心完成；測序結(jié)果利用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源序列檢索，然后采用MEGA5.0軟件進(jìn)行同源性分析，1 000次相似度重復(fù)計(jì)算，構(gòu)建以置信度為依據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 發(fā)酵液JJZ21數(shù)量動(dòng)態(tài)測定

按照1.2.1的操作步驟，進(jìn)行茶葉籽水漿發(fā)酵，取0～19 h（每小時(shí)1次）發(fā)酵液中層中間位置液體稀釋10 000倍，取0.2 mL稀釋液用涂布法進(jìn)行MRS固體培養(yǎng)基接種，然后于25℃恒溫培養(yǎng)36 h[9]，數(shù)出每個(gè)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，重復(fù)3次。

MRS固體培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[10]方法配制，另外每1 000 mL培養(yǎng)基中添加100 μL放線菌酮溶液，121℃、20 min高壓滅菌。放線菌酮溶液的配制：準(zhǔn)確稱取所需放線菌酮，用75%酒精配制成100 mg·mL-1的放線菌酮溶液，存放于 0～4℃冰箱中[11]。

1.2.5 茶葉籽水漿發(fā)酵液pH的測定

從發(fā)酵開始，每隔1 h取出發(fā)酵液50 mL，4 000 r·min-1離心 10 min，過濾，用 pH 計(jì)測定pH。

1.2.6 發(fā)酵液可溶性干物質(zhì)含量的測定

取清潔干燥培養(yǎng)皿編號，稱重，用移液管吸取1.2.5濾液3 mL放于培養(yǎng)皿中，置于60℃烘干至恒重，重復(fù)3次，由此測算出發(fā)酵液可溶性干物質(zhì)含量。

1.2.7 可溶性蛋白質(zhì)及可溶性糖測定方法

取適量1.2.5中過濾后的發(fā)酵液，加水稀釋，每個(gè)時(shí)間段稀釋倍數(shù)一致。取稀釋液1 mL，放入試管中（重復(fù) 3次），加入 5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，充分混合，放置2 min后，測定吸光度（595 nm），按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量[12]。取稀釋液1 mL，加蒽酮試劑 5 mL，顯色后用分光光度計(jì)在 620 nm下測定可溶性糖的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出可溶性糖含量[13]，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 2003處理，并采用SSPS 17.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 JJZ21菌株的鑒定

2.1.1 JJZ21菌株的菌落及個(gè)體形態(tài)

JJZ21菌株25℃培養(yǎng)48 h的菌落呈圓形，白色，凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體呈桿狀（圖1），大小 (0.5～0.7) μm×(0.8～1.7) μm，單個(gè)或成對排列，革蘭氏陽性。

2.2.3 JJZ21菌株的16 S rDNA及pheS基因序列測定及分析

圖1 JJZ21菌株的個(gè)體形態(tài)Fig. 1 Individual morphology of JJZ21

JJZ21菌株的16 S rDNA序列全長為1 417 bp，pheS基因序列全長為410 bp。利用BLAST進(jìn)行序列同源檢索，相似度達(dá)到98%以上的植物乳桿菌（Lactobacillus）近緣種有10種，其中與Lactobacillus plantarumssp. plantarum的相似度達(dá)到了100%。以16 S rDNA及pheS基因序列的同源性為基礎(chǔ)，用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果得到了如圖2和圖3所示的系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果可以看出，該系統(tǒng)樹中Lactobacillus plantarumssp. plantarumATCC 14917T（ACGZ01000098）是一個(gè)單獨(dú)的外群種，JJZ21菌株與該種單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支；二者序列的相似性最大，遺傳距離最小；但可靠性只有66%，不足以給出結(jié)論；但由圖3可以看出，JJZ21菌株仍然與Lactobacillus plantarumssp. Plantarum相似性最大，遺傳距離最小，且可靠性達(dá)到了100%；綜合兩種分析結(jié)果，可以初步結(jié)論：JJZ21菌株與Lactobacillus plantarumssp. Plantarum的親緣關(guān)系最近。

綜合形態(tài)觀察、16 S rDNA及pheS基因序列比對、以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院微生物檢測中心將JJZ21菌株鑒定為：Lactobacillus plantarumssp. Plantarum；結(jié)合我們的研究編號，JJZ21菌株定義為：Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21；為方便以后在茶葉籽水漿發(fā)酵工藝中使用，我們將 JJZ21菌株取名為茶葉籽乳桿菌（Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21）。該菌種已于2016年9月9日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏號為：CCTCC M 2016471。

2.2 茶葉籽乳桿菌在茶葉籽水漿發(fā)酵過程中的數(shù)量動(dòng)態(tài)

為了確定茶葉籽乳桿菌（Lactobacillus plantarumssp.plantarumJJZ21）在茶葉籽水漿發(fā)酵中的作用，測定了茶葉籽水漿發(fā)酵過程中不同時(shí)段發(fā)酵液中茶葉籽乳桿菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)，檢測結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，發(fā)酵5 h后，發(fā)酵液茶葉籽乳桿菌數(shù)量快速增長，到 13 h時(shí)，達(dá)到最大值（每毫升149.6萬個(gè)）；發(fā)酵進(jìn)行到13 h之后，菌體數(shù)量開始逐漸減小，發(fā)酵進(jìn)行到22 h之后，菌體數(shù)量逐漸維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平上。

圖2 以16 S rDNA序列為基礎(chǔ)的植物乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 The phylogenetic tree based on 16 S rDNA

圖3 以pheS基因序列為基礎(chǔ)的植物乳桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 The phylogenetic tree based on pheS gene

茶葉籽水漿發(fā)酵分層出現(xiàn)在發(fā)酵 5 h左右[2]；而茶葉籽乳桿菌數(shù)量是在發(fā)酵5 h之后才開始大量繁殖的，可見茶葉籽乳桿菌對于茶葉籽水漿發(fā)酵分層現(xiàn)象發(fā)生的早期作用不大。雖然茶葉籽水漿發(fā)酵分層最早發(fā)生在 5 h左右，但此時(shí)的頂層非常軟散，不能進(jìn)行茶葉籽油生產(chǎn)操作，一般要等到發(fā)酵 16 h時(shí)才是最佳操作點(diǎn)[3]；而茶葉籽乳桿菌是在5 h之后才進(jìn)行大量繁殖的，所以，發(fā)酵進(jìn)行到5 h之后，起主要發(fā)酵作用的微生物是茶葉籽乳桿菌；因此，茶葉籽乳桿菌是在茶葉籽水漿發(fā)酵中后期起主要作用的微生物。

2.4 茶葉籽乳桿菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液可溶性干物質(zhì)含量的變化

可溶性干物質(zhì)質(zhì)量：單位體積發(fā)酵液過濾后，60℃烘干后剩余物的質(zhì)量；用 60℃烘干是為了保證烘干后的可溶性干物質(zhì)不變性，便于后續(xù)的生化分析。茶葉籽水漿發(fā)酵液可溶性干物質(zhì)含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢如圖5，由圖5可以看出，可溶性干物質(zhì)含量的變化分為4個(gè)階段。

0～3 h之間（茶葉籽酵母[4]為主階段）：可溶性干物質(zhì)的含量隨時(shí)間的增加而增加，最高點(diǎn)比最低點(diǎn)（發(fā)酵零時(shí)）增加 37.5%；3～7 h之間（茶葉籽酵母為主階段）：可溶性干物質(zhì)含量隨時(shí)間的增加快速降低，最低點(diǎn)（7 h）比最高點(diǎn)（3 h）降低了62.5%；7～16 h（茶葉籽乳桿菌為主階段）之間：可溶性干物質(zhì)含量呈現(xiàn)震蕩緩慢走低趨勢，終點(diǎn)與本階段起始點(diǎn)相比降低了24.4%，與發(fā)酵初期最高點(diǎn)相比降低了71.7%；16 h以后可溶性干物質(zhì)含量呈現(xiàn)震蕩走平趨勢，意味著可溶性物質(zhì)含量不再降低，可溶性干物質(zhì)的消耗基本結(jié)束。

2.5 茶葉籽乳桿菌發(fā)酵過程中發(fā)酵液生化成分及pH的變化

茶葉籽水漿發(fā)酵液可溶性蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的變化趨勢分為兩個(gè)階段（圖6）。0～4 h，（茶葉籽酵母為主階段）可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)震蕩走高趨勢，在發(fā)酵4 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，最高點(diǎn)（7.95 μg·mL-1）比起始點(diǎn)（7.33 μg·mL-1）提高 8.4%?？扇苄缘鞍缀咳Q于茶葉籽中可溶性蛋白溶解于發(fā)酵液中的量，溶解得越多，發(fā)酵液可溶性蛋白的含量就越高。在一定范圍之內(nèi)，可溶性蛋白質(zhì)在水中的溶解量會隨水溫提高而增加。茶葉籽水漿發(fā)酵液開始的溫度一般是在 20℃左右，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液溫度會逐漸接近設(shè)定的發(fā)酵溫度（35℃）；隨著發(fā)酵液溫度的逐漸提高，可溶性蛋白的溶解量逐漸增加，導(dǎo)致發(fā)酵液可溶性蛋白的含量震蕩走高，在發(fā)酵 4 h時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)。4～19 h之間（茶葉籽乳桿菌為主階段）：發(fā)酵液可溶性蛋白含量呈現(xiàn)震蕩走低的趨勢，16 h之后，已基本穩(wěn)定，此時(shí)的質(zhì)量濃度（2.87 μg·mL-1）比最高點(diǎn)（7.95 μg·mL-1）降低了 63.9%。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)段JJZ21菌體數(shù)量動(dòng)態(tài)Fig. 4 The dynamic changes of JJZ21 number during fermentation

圖5 可溶性干物質(zhì)含量隨時(shí)間的變化動(dòng)態(tài)Fig. 5 The dynamic changes of soluble dry matter during fermentation

圖6 發(fā)酵液生化成分及pH隨時(shí)間的變化動(dòng)態(tài)Fig. 6 The biochemical component and pH of fermented tea seed water milk during fermentation

茶葉籽水漿發(fā)酵液可溶性糖含量隨時(shí)間的變化趨勢分為震蕩走高階段和震蕩下降階段兩個(gè)階段（圖6）。0～4 h為震蕩走高階段（茶葉籽酵母為主階段），發(fā)酵液可溶性糖含量呈現(xiàn)震蕩走高趨勢，最高點(diǎn)（8.11 μg·mL-1）比最低點(diǎn)（7.62 μg·mL-1）增加了 6.4%，其原因與上述可溶性蛋白相似，主要是由于發(fā)酵液的溫度升高及發(fā)酵液生化指標(biāo)的改變會導(dǎo)致可溶性糖的溶解度增加。4～19 h為震蕩下降階段（茶葉籽乳桿菌為主階段），發(fā)酵液可溶性糖含量迅速下降，最低點(diǎn)（19 h）比最高點(diǎn)（4 h）降低了60.5%。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液pH逐漸降低（圖6），由開始的最高點(diǎn)（6.28）逐漸降低到最低點(diǎn)（3.39），降幅達(dá) 46.0%。其中在發(fā)酵到5～9 h時(shí)，pH在4.5左右，根據(jù)茶葉籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)約為4.5的觀點(diǎn)[14]，此時(shí)發(fā)酵液pH正好接近茶葉籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，意味著此時(shí)發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)溶解性降低、失去與水的親和性，為茶葉子水漿發(fā)酵分層提供了一個(gè)促成因素。

2.6 茶葉籽乳桿菌數(shù)量與發(fā)酵液其他組分動(dòng)態(tài)之間的關(guān)系

茶葉籽水漿發(fā)酵分層過程是一個(gè)微生物活動(dòng)的過程；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液干物質(zhì)含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量及pH均逐漸降低，而乳桿菌的數(shù)量先增加后減少（表1）；這些降低是否與茶葉籽乳桿菌的活動(dòng)有關(guān)系，可以通過相關(guān)分析得出結(jié)論，分析結(jié)果如表2。由表2可以看出，上述4種指標(biāo)均與茶葉籽乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；結(jié)合圖4的情況可以看出，發(fā)酵5 h以后，茶葉籽乳桿菌的活動(dòng)是導(dǎo)致這些指標(biāo)降低的主要因素。

表1 發(fā)酵液各種組分及pH隨發(fā)酵時(shí)間的變化Table 1 Changes of various components in fermented liquid and pH during fermentation

表2 乳桿菌數(shù)量與發(fā)酵液其他組分及pH之間的相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of the number of LPJJZ21 and other components and pH in fermented liquid

茶葉籽乳桿菌通過消耗發(fā)酵液中的可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)等物質(zhì)，向發(fā)酵液中分泌乳酸等酸性有機(jī)物，導(dǎo)致發(fā)酵液pH逐漸降低，為發(fā)酵液中的油脂體（蛋白質(zhì)包裹的油脂顆粒）上浮創(chuàng)造了條件，進(jìn)而導(dǎo)致茶葉籽水漿發(fā)酵分層現(xiàn)象發(fā)生。值得說明的是pH降低只是發(fā)酵分層現(xiàn)象發(fā)生的因素之一，僅僅靠pH的變化不能完成發(fā)酵分層作用。

茶葉籽中的可溶性蛋白及可溶性糖是茶葉籽毛油生產(chǎn)過程中美拉德反應(yīng)的原料，美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物會導(dǎo)致毛油的紅色值增加[20]。茶葉籽水漿發(fā)酵液中可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量大幅度降低，導(dǎo)致發(fā)酵法茶葉籽毛油的紅色值大幅度降低，這是發(fā)酵法茶葉籽毛油色澤較壓榨法毛油較淺的重要原因之一。

3 討論

3.1 關(guān)于茶葉籽乳桿菌

茶葉籽乳桿菌是植物乳桿菌（L.plantarumssp.plantarum）的一個(gè)菌株。植物乳桿菌由于其自身的益生特性及生物學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于酸奶、干酪、乳酸菌飲料、干腸發(fā)酵、發(fā)酵泡菜及發(fā)酵調(diào)味品等食品中。例如：Seunggyu L等[15]對分離自泡菜中的植物乳桿菌生產(chǎn)酸奶的研究表明，該酸奶具有較好的抑菌功效。Erkkil? S等[16]應(yīng)用植物乳桿菌發(fā)酵干腸，得到了新風(fēng)味的干腸制品。周光燕等[17]將植物乳桿菌接種到泡菜中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明植物乳桿菌可明顯降低泡菜中亞硝酸鹽的含量。郭翔等[18]對植物乳桿菌作為益生菌的生物安全性做了研究，結(jié)果表明，植物乳桿菌對人體是安全無害的。綜上所述，植物乳桿菌是一個(gè)具有廣泛食品生產(chǎn)用途，且無毒無害的發(fā)酵微生物，因此，利用茶葉籽乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的茶葉籽油、茶皂素及茶葉籽淀粉對人體也是安全的。值得一提的是茶葉籽水漿中含有大量的茶皂素，茶皂素具有很強(qiáng)的抑菌作用[19]，但是，茶葉籽乳桿菌（JJZ21）卻能在高濃度的茶皂素溶液里安全快速繁殖生長，并完成發(fā)酵作用，這是一個(gè)值得進(jìn)一步研究的現(xiàn)象。

3.2 茶葉籽乳桿菌與茶葉籽酵母的協(xié)同作用

酵母能夠在不同程度上促進(jìn)植物乳桿菌的生長[21]，在茶葉籽水漿發(fā)酵過程中，茶葉籽乳桿菌與茶葉籽酵母（Meyerozyma caribbicaJJZ11）之間也存在類似的促進(jìn)關(guān)系，雙方協(xié)作完成了茶葉籽水漿的發(fā)酵作用。姜金仲認(rèn)為[4]，發(fā)酵液中茶葉籽酵母細(xì)胞的數(shù)量5 h之前居最高位，5 h之后迅速下降，到10 h時(shí)基本為零。本文中茶葉籽乳桿菌從發(fā)酵5 h開始快速生長，正好接替了茶葉籽酵母數(shù)量的下降。由此可以看出，發(fā)酵初期（5 h以前），茶葉籽酵母的發(fā)酵作用為茶葉籽乳桿菌提供了適宜生長環(huán)境，茶葉籽乳桿菌才得以快速增長，從而體現(xiàn)了二者的協(xié)同作用。茶葉籽水漿發(fā)酵分層開始在5～7 h之間，但分層理想狀態(tài)是在16 h[2]，結(jié)合茶葉籽酵母及茶葉籽乳桿菌的數(shù)量變化動(dòng)態(tài)可以看出，只有兩種微生物共同協(xié)作，才能有效完成發(fā)酵法茶葉籽油生產(chǎn)工藝的發(fā)酵分層。

4 結(jié)論

JJZ21菌株是從茶葉籽水漿發(fā)酵液中分離出的一種桿菌，通過分離提純、形態(tài)觀察、16 S rDNA及pheS基因測序與比對、以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與分析，確定JJZ21為L. plantarumssp.plantarum桿菌的一個(gè)菌株；并將該菌株命名為：茶葉籽乳桿菌（L. plantarumssp.plantarumJJZ21）；菌種保藏號為CCTCC M 2016471。在茶葉籽水漿發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中JJZ21菌體的數(shù)量5 h之后逐漸快速增加，到13 h時(shí)達(dá)到最大值，之后又逐漸降低，直至 22 h之后，又逐漸趨于穩(wěn)定。茶葉籽水漿發(fā)酵過程中，茶葉籽乳桿菌需要茶葉籽酵母預(yù)先為其提供適宜的生長環(huán)境才能夠快速繁殖生長。

茶葉籽水漿發(fā)酵過程中，伴隨著茶葉籽乳桿菌數(shù)量的增加，發(fā)酵液中的干物質(zhì)含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量及pH均明顯下降，呈現(xiàn)極顯著（P＜0.01）的負(fù)相關(guān)。茶葉籽乳桿菌通過消耗發(fā)酵液中的可溶性糖及可溶性蛋白等物質(zhì)，向發(fā)酵液中分泌乳酸等酸性有機(jī)物，導(dǎo)致發(fā)酵液pH逐漸降低，為發(fā)酵液中的油脂體上浮創(chuàng)造了條件，進(jìn)而導(dǎo)致茶葉籽水漿發(fā)酵分層現(xiàn)象發(fā)生。發(fā)酵液可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量的降低還能使發(fā)酵法茶葉籽毛油的色澤變淡。