誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)與應(yīng)用前景

李奧哲

【摘 要】誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）于2006年被Yamanaka等人發(fā)現(xiàn)后，一度成為研究熱點(diǎn)。由于iPSC細(xì)胞具有類似于胚胎干細(xì)胞的增殖潛力與分化能力，且能夠通過重編程體細(xì)胞來獲得，因而相比于胚胎干細(xì)胞具有極大的應(yīng)用潛力與優(yōu)勢。此外，在臨床治療中，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠完成多種細(xì)胞類型的分化，甚至可以再生組織器官，因而對于目前較難治愈的某些器官病變疾病有顯著的療效。本文將從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞概述、分子機(jī)制、誘導(dǎo)手段、成果應(yīng)用以及目前遇到的困難進(jìn)行簡要介紹。

【關(guān)鍵詞】 iPSCs；分子機(jī)制；重編程；細(xì)胞治療

【中圖分類號】R181.3+2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）17-291-01

1 iPS細(xì)胞概述

體細(xì)胞可以重新編程到多能狀態(tài)下的發(fā)現(xiàn)使干細(xì)胞研究的前景發(fā)生了深刻的改變。這種可以分化的細(xì)胞可以通過將核的內(nèi)容信息轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞或與胚胎干細(xì)胞融合而重新編程到胚胎狀態(tài)從而實(shí)現(xiàn)多潛能，讓普通體細(xì)胞“初始化”，使其具備再造干細(xì)胞功能，這就是“iPS細(xì)胞”?！癷PS細(xì)胞”具有和胚胎干細(xì)胞類似的功能，這種重新編程的原理不僅避免了使用胚胎收集和培養(yǎng)ESCs的必要性，而且還帶來了避免移植排斥和移植物抗宿主病等免疫問題的額外預(yù)期優(yōu)勢。因?yàn)樽畛醯膶?shí)驗(yàn)證明小鼠和人類（成纖維細(xì)胞可以被重新編程通過病毒特異性過表達(dá)成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）轉(zhuǎn)錄因子，許多方法已經(jīng)被發(fā)展來產(chǎn)生iPSCs。這些方法可提高重編程細(xì)胞的效率和產(chǎn)生無足跡的iPSC，它們是沒有整合任何病毒載體序列基因組，然后通過將基因組進(jìn)行分析和探索得出目的。下文將回顧iPSC信號通路和重新編程方法的當(dāng)前狀態(tài)，集中于關(guān)注人類細(xì)胞的重新編程的各種措施，也會相應(yīng)的提到對于小鼠細(xì)胞和其他更多的重新編程的方法手段。

2 iPS細(xì)胞分子機(jī)制

獲得iPS細(xì)胞中最重要的步驟就是體細(xì)胞重編程，其中牽涉到的遺傳因子有上文提到的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc以外，還有Nanog、Lin28等。在Takahashi和Yamanaka的研究中已經(jīng)證明了重編程過程中可以不需要Nanog、Lin28。雖然Nanog對于維持胚胎干細(xì)胞多能性并不是不可或缺的，但因其能夠阻礙分化，所以仍是重編程過程中的一個重要因子（ 。在同樣的研究中，Silva等人發(fā)現(xiàn)Nanog能夠作為一個分子開關(guān)從而調(diào)控哺乳動物細(xì)胞中一些多能性源序列表達(dá)[1]。至于c-Myc因子則不同于以上提到的所有因子，由于它在重編程的最后步驟中不回上調(diào)多能性基因網(wǎng)絡(luò)的表達(dá)，因而它也不是必需的。c-Myc主要作用在于提高重編程過程的效率與動力學(xué)速率。而在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)Oct4作為核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)回路最后一個因子也是重編程中最重要的因子（Walia， Satija et al. 2012）。但同樣有研究表明，一種叫做肝臟受體同系物-1（LRH-1）可以取代Oct4，并且能夠提高重編程的效率（Heng， Feng et al. 2010）。

關(guān)于iPS細(xì)胞中信號通路的研究目前證明有以下四種：Wnt通路，TGF-β通路，p53通路與BMP通路。下面我們通路來分別進(jìn)行簡要介紹前三種通路。

Wnt通路中發(fā)現(xiàn)被稱為BIO的糖原合成激酶-3抑制因子作為Wnt通路下游效應(yīng)因子能夠維持人類和小鼠胚胎干細(xì)胞的多能性（Sato， Meijer et al. 2004）。而另一種GSK3抑制劑CHIR999021則證明能夠彌補(bǔ)人類iPS細(xì)胞中Sox2缺失的情況。根據(jù)以上的研究推測，Wnt通路可以通過產(chǎn)生GSK3抑制因子來維持干細(xì)胞特性。其他研究則發(fā)現(xiàn)Oct4與Wnt/β-鏈蛋白通路能夠聯(lián)合作用從而調(diào)節(jié)Wnt信號來維持干細(xì)胞特性并決定細(xì)胞命運(yùn)。

TGF-β通路在目前是研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β主要在維持干細(xì)胞多能狀態(tài)中起到重要作用。TGF-β/激活素通路能夠促進(jìn)人類胚胎干細(xì)胞的增殖與自我更新。前文提到的Nanog因子更是TGF-β/激活素通路的直接調(diào)節(jié)目標(biāo)，其中的具體調(diào)節(jié)機(jī)制已經(jīng)證明是Smad共激活因子與Nanog近端啟動子結(jié)合，從而使得Nanog表達(dá)上調(diào)。雖然也有研究發(fā)現(xiàn)使用TGF-β受體/Alk5激酶抑制劑抑制TGF-β通路之后反而增強(qiáng)了小鼠iPS細(xì)胞重編程的效率，并且該抑制劑也能夠替代Sox2和c-Myc因子。但是在人類iPS細(xì)胞中并沒有發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)論?？梢钥闯鲆种芓GF-β通路所產(chǎn)生的效應(yīng)較為復(fù)雜，并且相關(guān)研究并不能得出統(tǒng)一結(jié)論，所以還有待進(jìn)一步研究證明該通路作用機(jī)理與明確作用效果。

p53作為研究最深入的抑癌因子之一，在調(diào)節(jié)體細(xì)胞重編程過程中有著重要的保護(hù)作用。p53-p21通路除了在腫瘤形成過程中有阻礙作用，在iPS細(xì)胞生成中同樣有著抑制過度增殖的保護(hù)作用。另有研究表明大多數(shù)沒有敲除p53的細(xì)胞能夠通過重編程成為iPS細(xì)胞或者成為永生性細(xì)胞（Hanna， Saha et al. 2009）。而單細(xì)胞水平檢測發(fā)現(xiàn)敲低p53之后的大部分細(xì)胞脫離重編程路徑，最終整體重編程效率較低。因而有研究認(rèn)為未來效率更高的重編程應(yīng)該著重選擇p53略低且增殖能力更強(qiáng)的細(xì)胞，而不能完全沉默p53通路。

3 iPS細(xì)胞誘導(dǎo)手段

3.1 嘗試誘導(dǎo)小鼠的IPSC Takahashi和Yamanaka研究表明，完全表達(dá)已定義的轉(zhuǎn)錄因子也能將細(xì)胞（或細(xì)胞核）轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)。在ESCs中維持多能性的因素可能在體細(xì)胞中誘導(dǎo)多能性。為了探明因素的作用，他們測試了24個轉(zhuǎn)錄因子在mESC中的重要作用。他們通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將這些基因的組合導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞。這些細(xì)胞攜帶了一種耐抗生素基因，這種基因由β-半乳糖苷酶與新霉素的融合蛋白組成，它只有在F-box蛋白15基因（Fboxo15）被激活時(shí)才會表達(dá)，在表達(dá)后使用G418對融合蛋白進(jìn)行篩選。他們設(shè)計(jì)了這個實(shí)驗(yàn)，通過逐步排查，最后他們發(fā)現(xiàn)只有四種因素足以產(chǎn)生類似于ESC的菌落?；蚪M合為Oct3/4，Sox2， Klf4， c-Myc。這些重編程細(xì)胞被命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）。

3.2 Cre-Lox轉(zhuǎn)基因敲除介導(dǎo)的單個盒式重編程載體 由于慢病毒能夠感染不分裂和增殖的細(xì)胞，因而它成為體細(xì)胞表達(dá)重編程因子更好的運(yùn)載體。但是這種方法有兩種弊端，一是其效率達(dá)不到使用要求，二是存在慢病毒的載體可能整合進(jìn)入iPS細(xì)胞的基因組中的風(fēng)險(xiǎn)。為解決這些弊端，研究采用開發(fā)一種單個盒式重編程載體，并在其中每個重編程因子能夠彼此分開[2]，以自切肽信號的形式分布到每個載體中。這些載體中一部分就是構(gòu)建LoxP位點(diǎn)，以此通過Cre重組酶的過表達(dá)來切斷任何連續(xù)整合的序列。

3.3 非病毒重編程方法

3.3.1 mRNA轉(zhuǎn)染 通過轉(zhuǎn)染mRNA的方式使受體細(xì)胞表達(dá)重編程因子同樣是一種無足跡制備iPS細(xì)胞的方法。有研究通過此方法在轉(zhuǎn)染20天內(nèi)人成纖維細(xì)胞重編程效率達(dá)到1.4%（Warren， Manos et al. 2010）。在此基礎(chǔ)上，將Lin28因子、丙戊酸加入到Y(jié)amanaka重編程方案中，在O2下培養(yǎng)，重編程效率可以提高到4.4%。盡管重編程因子的mRNA能夠買到，且效率較高，但目前除成纖維細(xì)胞以外并沒有成功的案例。

3.3.2 miRNA感染/轉(zhuǎn)染 在胚胎干細(xì)胞中有幾個miRNA簇得到強(qiáng)烈表達(dá)。當(dāng)miR-302b和miR-372加上四種慢病毒Yamanaka因子合成模擬物添加到MRC5和BJ-1成纖維細(xì)胞后重編程效率比只加入四種慢病毒因子提高10-15倍（Subramanyam， Lamouille et al. 2011）。而某些miRNA同樣能夠在沒有Yamanaka因子時(shí)仍舊能維持高效重編程人類細(xì)胞。只使用miR302/367的種子序列在轉(zhuǎn)染12-14天后仍大約有10%的BJ-1成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSC（Anokye-Danso， Trivedi et al. 2011）。

3.4 卵母細(xì)胞重編程 體細(xì)胞基因組通過轉(zhuǎn)移進(jìn)去核卵母細(xì)胞中能夠迅速得到重編程，作為iPS細(xì)胞的一種替代技術(shù)。這種技術(shù)在包括小鼠在內(nèi)的數(shù)種物種中效率幾乎是100%。然而，限于倫理與部分技術(shù)原因，這項(xiàng)技術(shù)在人類中并沒有得到很好的實(shí)施。有研究通過成纖維細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到未去除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中進(jìn)行重編程從而得到了目的細(xì)胞。這種方法得到的重編程細(xì)胞與iPS細(xì)胞的表達(dá)譜與表觀遺傳學(xué)標(biāo)記都十分相似。由于重編程的細(xì)胞是三倍體，所以不能用于臨床治療，只能用于科學(xué)研究，也因此得以進(jìn)行。目前該方法受限于倫理難以開展，所以仍需進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)，尋找符合倫理道德的類卵母細(xì)胞載體。

4 iPS細(xì)胞的應(yīng)用

科學(xué)研究方面，iPS細(xì)胞能夠作為研究發(fā)育中特定時(shí)期的特定分子機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)材料，在不違背倫理道德的基礎(chǔ)上開展更深層次的發(fā)源發(fā)育研究。同時(shí)也能夠?yàn)檠芯坎±頇C(jī)制、藥物作用等臨床研究提供基本的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為臨床科研的發(fā)展做出巨大的推動。

臨床應(yīng)用方面，iPS細(xì)胞能夠在特定條件下培養(yǎng)形成擬胚體（EB）結(jié)構(gòu)，并可以在EB結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上通過不同因子誘導(dǎo)分化形成不同類型的功能性細(xì)胞，例如造血干細(xì)胞（Raya， Rodriguez-Piza et al. 2009）、胰島B細(xì)胞（Maehr， Chen et al. 2009）、運(yùn)動神經(jīng)元（Dimos， Rodolfa et al. 2008）等。iPS細(xì)胞的主要應(yīng)用方式有兩種，一方面通過誘導(dǎo)形成正常細(xì)胞、組織從而替代病變損傷的細(xì)胞、組織，達(dá)到治愈目的，另一方面通過誘導(dǎo)形成的正常功能細(xì)胞，分泌相應(yīng)物質(zhì)，如黑色素等，治療相應(yīng)疾病。

這種治療手段是細(xì)胞治療中極具前景的方法之一，既不受限于倫理、道德、法律，又可以避免免疫排斥等問題，而且能夠治療很多目前醫(yī)療手段無法治愈的遺傳疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疑難雜癥。

5 iPS細(xì)胞應(yīng)用中的困難

iPS 細(xì)胞的出現(xiàn)不僅僅因?yàn)樗鼙苊馊梭w胚胎克隆技術(shù)引發(fā)的倫理爭議，更由于它突破了以往只能利用卵子和胚胎的取材限制，其高效、便利為再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用打開了大門，為未來干細(xì)胞用于個體治療帶來了希望，其應(yīng)用價(jià)值十分令人期待， 但在應(yīng)用于人體細(xì)胞移植或藥物研究領(lǐng)域還面臨很多問題有待解決。

5.1 致癌風(fēng)險(xiǎn) 這是制約 iPS 細(xì)胞在多個醫(yī)療應(yīng)用的首要因素.在培育iPS細(xì)胞時(shí)，需要依靠逆轉(zhuǎn)錄酶病毒或慢病毒將這4個（Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4）基因?qū)塍w細(xì)胞，而使用病毒載體有可能引發(fā)腫瘤形成，因其利用病毒誘導(dǎo)得到的 iPS 細(xì)胞基因組中整合了用于重編程的基因， 并能在之后的分化過程中穩(wěn)定存在， 增加了患癌的風(fēng)險(xiǎn)。此外，每次實(shí)驗(yàn)前都要制作新的病毒載體，對操作過程時(shí)間的把控和實(shí)驗(yàn)室的管理要求嚴(yán)格。因此， 需要在提高安全性的同時(shí)， 同時(shí)還要高效地獲得臨床級別的患者特異性 iPS細(xì)胞，這些問題的難度都阻礙著iPS細(xì)胞技術(shù)的普及與在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用。

5.2 轉(zhuǎn)化機(jī)制的未知性 iPS 細(xì)胞的再分化機(jī)制還不明確， 人類仍不能按照自己的意愿將其定向分化為所需的細(xì)胞.正因如此，我們需去更深入的探索如何確保分化后的功能細(xì)胞移植后能穩(wěn)定地發(fā)揮功效而不會違反意愿產(chǎn)生了不必要甚至具有危害作用的副作用。通過對其機(jī)制的充分研究明確清楚對于iPSCs 和成體細(xì)胞之間轉(zhuǎn)變的機(jī)制， 以及重編程過程又是如何發(fā)生的。因此， 需要進(jìn)一步深入研究 iPS 細(xì)胞定向分化的分子機(jī)理，從機(jī)制入手解決各類實(shí)際問題。

5.3 iPS細(xì)胞產(chǎn)生速率緩慢且功能效率低 通過提高 iPS 細(xì)胞的分化效率， 從而高效地獲得所需的功能性細(xì)胞，這是目前對于iPS細(xì)胞去投入實(shí)際應(yīng)用的一大具體的問題，在研究過程中發(fā)現(xiàn)一些手段我們可以提高速率，但是要進(jìn)入實(shí)際不僅是運(yùn)用藥劑成本的高低問題，還包括了脫離實(shí)驗(yàn)室后能否切實(shí)的產(chǎn)生預(yù)期的目的，這都是需要時(shí)間與物力人力的檢驗(yàn)。再當(dāng)發(fā)現(xiàn)能夠解決這個問題的方法之后我們才能進(jìn)入理論上對于iPS細(xì)胞的預(yù)期實(shí)踐，而使iPS細(xì)胞在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)存在一席之地。

以上都證明iPS細(xì)胞的應(yīng)用方面還存在很多的疑惑與困難，相信在未來隨著研究水平不斷提高，相關(guān)領(lǐng)域的深度、廣度不斷增加，相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)的不斷開展，人們終有一天能夠享受到誘導(dǎo)多能干細(xì)胞為健康生活創(chuàng)造的巨大福利。

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