棉花應(yīng)答逆境脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

吳巧娟++徐劍文++劉劍光++趙君 肖松華++袁有祿

摘要：蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來(lái)隨著人類基因組計(jì)劃完成而逐步興起的生命科學(xué)領(lǐng)域的又一研究熱點(diǎn)。本文系統(tǒng)綜述了棉花鹽堿脅迫、低溫脅迫、干旱脅迫和病害脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展，并對(duì)利用蛋白質(zhì)組學(xué)深入研究棉花與各種逆境互作的分子機(jī)制進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：棉花；逆境脅迫；分子機(jī)制；應(yīng)答；蛋白質(zhì)組學(xué)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)： S562.01；Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0022-02[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2015-11-10

基金項(xiàng)目：[JP2]棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號(hào)：CB2014A16）。

作者簡(jiǎn)介：吳巧娟（1978—），女，浙江浦江人，碩士，從事棉花資源創(chuàng)新利用研究。E-mail：luyuewu@163.com。

通信作者：肖松華，研究員。E-mail：njxsh@sina.com。

棉花是世界主要的經(jīng)濟(jì)作物和天然纖維作物，也是研究植物纖維發(fā)育最為理想的模式作物，同時(shí)又具有較強(qiáng)的耐鹽性，是改良鹽堿地較為理想的先鋒作物。蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來(lái)隨著人類基因組計(jì)劃完成而逐步興起的生命科學(xué)領(lǐng)域又一研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組（proteome）的概念最先由MarcWilkins提出，是指由一個(gè)基因組（genome）或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)（protein）[1]。近年來(lái)，許多學(xué)者相繼開展棉花基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的研究，并取得了一些進(jìn)展。本文較為系統(tǒng)地回顧了棉花逆境脅迫應(yīng)答的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展，為利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入研究棉花應(yīng)對(duì)逆境脅迫的分子機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

1逆境脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，經(jīng)常會(huì)遭受病菌、害蟲等生物脅迫和低溫、干旱和鹽堿等非生物脅迫。由于這些不良環(huán)境條件對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育或繁殖產(chǎn)生負(fù)面影響，因此植物自身在遭遇、適應(yīng)這些脅迫過程中產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，并引起多個(gè)相關(guān)通路的蛋白發(fā)生種類和表達(dá)量變化。

1.1棉花高鹽脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

鹽脅迫與植物生理和代謝密切相關(guān)，是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最主要的非生物脅迫之一。然而，目前世界上約20%的耕地和50%的灌溉地正在遭受鹽分的影響，土壤鹽漬化是目前制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問題。棉花具有較強(qiáng)的耐鹽性，其中非洲棉和海島棉的耐鹽性優(yōu)于陸地棉和亞洲棉。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者利用蛋白質(zhì)組學(xué)圍繞棉花耐鹽機(jī)理等方面開展了大量研究，并取得了很大進(jìn)展。

雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術(shù)是目前較為常用的分離蛋白質(zhì)的重要技術(shù)，研究者利用雙向電泳技術(shù)對(duì)棉纖維發(fā)育機(jī)理進(jìn)行探索[2-4]，確定“-3 DPA”是纖維起始發(fā)育的開始，并發(fā)現(xiàn)了眾多與棉纖維發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)。當(dāng)前，也有研究者利用雙向電泳技術(shù)分離棉花耐鹽相關(guān)蛋白質(zhì)的報(bào)道[5-9]。研究者主要圍繞棉花葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳的技術(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，并分離到涉及光呼吸、細(xì)胞防御以及氨基酸代謝等信號(hào)途徑中的蛋白質(zhì)。

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ） 技術(shù)可以利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來(lái)定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)。周仲華等基于iTRAQ技術(shù)，針對(duì)采用漂浮育苗、傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)缽育苗分別進(jìn)行鑒定、比較分析，確定枯草桿菌酶家族蛋白（subtilase family protein）、α/β水解酶（alpha/beta-Hydrolases）、超家族蛋白（superfamily protein）等6個(gè)與棉花水浮育苗適應(yīng)性高度相關(guān)的棉花耐澇漬關(guān)鍵基因。而王麗等同樣利用iTRAQ技術(shù)鑒定出169個(gè)與棉花苗期與水分脅迫相關(guān)的差異蛋白，且發(fā)現(xiàn)磷酸果糖激酶（phosphofructokinase1）等糖酵解途徑中的蛋白在漂浮育苗根系中比營(yíng)養(yǎng)缽育苗根系中表達(dá)量更高[10]。許菲菲也運(yùn)用iTRAQ技術(shù)對(duì)NaCl不同脅迫時(shí)期下蛋白質(zhì)的差異進(jìn)行了研究，結(jié)果鑒定出121個(gè)差異蛋白，并發(fā)現(xiàn)鹽敏感品系“被動(dòng)”抵抗鹽脅迫，而耐鹽品系則通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及清除活性氧“主動(dòng)”抵抗鹽脅迫傷害，有助于進(jìn)一步揭示棉花耐鹽分子機(jī)制[11]。

1.2棉花低溫脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

植物響應(yīng)低溫脅迫是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控反應(yīng)，眾多低溫響應(yīng)蛋白在此網(wǎng)絡(luò)途徑中起重要作用。目前，也有許多有關(guān)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究棉花低溫脅迫的分子機(jī)制的研究報(bào)道[12-14]。邰付菊等對(duì)5日苗齡的棉花于4 ℃下處理12 h，利用2-DE技術(shù)得到49個(gè)顯著差異的蛋白點(diǎn)，其中低溫處理后上調(diào)的有27個(gè)，減弱表達(dá)的有22個(gè)[12]。李銳等則對(duì)耐低溫能力強(qiáng)的品種錦3047和不耐低溫的品種410進(jìn)行了蛋白質(zhì)組比較分析，發(fā)現(xiàn)錦3047的50個(gè)蛋白點(diǎn)在低溫脅迫前后的表達(dá)量有明顯差異，其中19個(gè)蛋白質(zhì)在錦3047中表達(dá)豐度增大，并明顯高于品種410，11個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)豐度變小，且低于品種410[14]。對(duì)入選的錦3047的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析、鑒定，得到30個(gè)蛋白的完整肽指紋圖譜，其中逆境蛋白占20%。以上研究為今后研究棉花耐低溫分子機(jī)制提供了良好的研究基礎(chǔ)，同時(shí)也可以看出更加深入具體的研究工作尚需要積極開展。

1.3棉花干旱脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

隨著全球氣候變暖，旱災(zāi)時(shí)有發(fā)生。干旱已經(jīng)嚴(yán)重影響我國(guó)的棉花生產(chǎn)。因此，也有研究者采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，鑒定干旱脅迫蛋白，研究棉花耐旱機(jī)制[6，15-17]。陸許可等運(yùn)用2-DE技術(shù)對(duì)抗旱品種中H177和不抗旱品種中S9612為材料進(jìn)行蛋白質(zhì)組分差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，這2個(gè)品種棉花葉片蛋白表達(dá)差異較大，并通過質(zhì)譜分析鑒定出43個(gè)差異蛋白，進(jìn)一步功能分類分析表明干旱脅迫蛋白參與光合作用、物質(zhì)與能力代謝、抗逆相關(guān)蛋白、物質(zhì)運(yùn)輸和活性氧清除；Rubisco活化酶和能量代謝相關(guān)蛋白ATP合成酶類表達(dá)差異最大[16]。郭忠軍則對(duì)PEG處理苗期的棉花葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，鑒定得到102個(gè)蛋白點(diǎn)，經(jīng)功能分類分析發(fā)現(xiàn)，它們除參與上述相關(guān)途徑外，還與氨基酸和蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞加工以及分子伴侶等過程有關(guān)[6]。以上研究結(jié)果對(duì)探討了解棉花抗旱機(jī)理進(jìn)而指導(dǎo)棉花抗旱育種等方面都具有極其重要的意義。

1.4病菌脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

黃萎病（Verticillium dahliae）是棉花主要病害之一，嚴(yán)重影響我國(guó)各地棉花產(chǎn)量。近年來(lái)，也有諸多研究工作者利用蛋白質(zhì)組學(xué)手段對(duì)棉花黃萎病的侵染機(jī)制等方面展開研究的報(bào)道[18-21]。王雪等研究發(fā)現(xiàn)，大量新的蛋白質(zhì)在黃萎病病菌脅迫下在棉花葉片中被誘導(dǎo)產(chǎn)生，由此推測(cè)DEAD/H-box RNA解旋酶（helicase）、絲氨酸蛋白酶抑制劑和ODR-3蛋白可能參與棉花對(duì)黃萎病的抗性反應(yīng)[18]。Xie等則發(fā)現(xiàn)黃萎病病菌侵染棉花后，棉花首先建立了早期的與活性氧（reactive oxygen species，ROS）、細(xì)胞死亡等蛋白質(zhì)有關(guān)的防御反應(yīng)，同時(shí)黃萎病毒素通過調(diào)控宿主蛋白質(zhì)的合成來(lái)誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡，并且快速誘導(dǎo)老葉片細(xì)胞死亡[19-20]。此外，也有研究者從代謝角度分析闡述了棉花和黃萎病病菌之間的互作機(jī)制。如高巍利用2-DE方法獲得了188個(gè)在黃萎病菌侵染海7124根系中差異表達(dá)的蛋白，分類分析結(jié)果表明大多數(shù)蛋白與細(xì)胞工程、代謝過程和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，說(shuō)明病菌侵染后正常情況下的細(xì)胞過程和生理代謝都發(fā)生了很大變化；進(jìn)而他們針對(duì)蛋白表達(dá)譜中發(fā)現(xiàn)的2個(gè)與棉酚代謝相關(guān)的酶進(jìn)行了功能研究，證明棉酚可能影響棉花對(duì)黃萎病病菌的抗性[21]。

棉花根黑腐病也是目前生產(chǎn)上造成棉花植株死亡的主要病害之一。Coumans等利用2-DE技術(shù)針對(duì)棉花根黑腐病病菌（Thielaviopsis basicola）侵染機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了包括致病蛋白和活性氧等防御和脅迫有關(guān)的蛋白、糖和氮代謝以及類異戊二烯合成等有關(guān)的蛋白[22]。

2前景與展望

除上述研究報(bào)道外，也有學(xué)者對(duì)棉花在NO等脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究[23]?？偠灾S著棉花基因組測(cè)序的完成以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在棉花逆境脅迫中的廣泛應(yīng)用，不僅有利于解析棉花應(yīng)答各種逆境脅迫的分子機(jī)制，而且還對(duì)棉花抗逆品種培育等工作產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。盡管目前研究者利用蛋白組學(xué)技術(shù)已經(jīng)獲得了大量有關(guān)棉花抗逆的信號(hào)途徑和蛋白信息，但目前尚未明確這些細(xì)胞代謝途徑以及各種防御蛋白如何參加棉花應(yīng)對(duì)逆境脅迫的分子機(jī)制。相信在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)等多學(xué)科綜合信息指導(dǎo)下，棉花應(yīng)對(duì)各種逆境脅迫的分子機(jī)理逐步被揭示，必將迎來(lái)棉花后基因組時(shí)代的蓬勃發(fā)展，推動(dòng)棉花抗逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的遺傳解析和抗逆境新品種的創(chuàng)制。

[HS2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：[HT8.SS]

[1][ZK（#]朱小燕. 蛋白質(zhì)組學(xué)及其在植物生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用.2008[J]. 淮陰工學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，17（1）：68-71.

[2]Graves D A，Stewart J M. Analysis of the protein constituency of developing cotton fibers[J]. J Exp Bot，1988，39：59-69.

[3]Ferguson D L，Turley R B，Triplett B A，et al. Comparison of protein profiles during cotton（Gossypium hirsutum L.） fiber cell wall development with partial sequences of two proteins[J]. J Agr Food Chem，1996，44：4022-4027.

[4]Yao Y，Yang Y W，Liu J Y. An efficient protein preparation for proteomic analysis of developing cotton fibers by 2-DE[J]. Electrophoresis，2006，27（22）：4559-4569.

[5]徐子劍，舒驍，楊亦瑋，等. 棉花纖維蛋白質(zhì)3種提取及二維電泳方法的比較[J]. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2006，22（1）：77-80.

[6]郭忠軍. 干旱脅迫下棉花蛋白質(zhì)組雙向電泳體系構(gòu)建與差異表達(dá)蛋白功能分析[Z]，2012.

[7]韓吉春，崔海峰，時(shí)鵬濤，等. 棉花葉片雙向電泳體系的研究[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2012，24（1）：27-34.

[8]孫峰，王云生. 鹽協(xié)迫下AM菌侵染的棉花幼苗根系蛋白質(zhì)組分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26（1）：170-175.

[9]Cui Y P，Lu X K，Wang D L，et al. Comparative analysis of salinity-induced proteomic changes in cotton（Gossypium hirsutum L.）[J]. Agricultural Sciences，2015，6（1）：78-86.

[10][ZK（#] 王麗，周仲華，鄭順利，等. 基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的棉花耐澇漬基因初步鑒定[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2014，26（4）：283-289.

[11]許菲菲. 棉花苗期葉片鹽脅迫差異蛋白質(zhì)分析[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014.

[12]邰付菊，李揚(yáng)，陳良，等. 低溫脅迫下棉花子葉蛋白質(zhì)差異表達(dá)的雙向電泳分析[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，42（2）：262-266.

[13]蓋英萍. 棉花、煙草響應(yīng)低溫脅迫的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[14]李銳，李生泉，范月仙. 不同抗冷級(jí)別的棉苗低溫誘導(dǎo)蛋白比較[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2010，22（3）：254-259.

[15]Deeba F，Pandey A K，Ranjan S，et al. Physiological and proteomic responses of cotton （Gossypium herbaceum L.） to drought stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2012，53：6-18.

[16]陸許可，張德超，陰祖軍，等. 干旱脅迫下不同抗旱水平陸地棉的葉片蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（12）：2401-2409.

[17]張德超. 棉花葉片干旱脅迫蛋白的表達(dá)分析與鑒定[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

[18]王雪，馬駿，張桂寅，等. 黃萎病菌脅迫條件下棉花葉片的蛋白質(zhì)組分析[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2007，19（4）：273-278.

[19]Xie C J，Wang C Y，Wang X K，et al. Proteomics-basedanalysis reveals that Verticillium dahliae toxin induces cell death by modifying the synthesis of host proteins[J]. Journal of General Plant Pathology，2013，79（5）：335-345.

[20]謝成建. 棉花在黃萎病菌侵染早期的蛋白質(zhì)組及表達(dá)譜分析[D]. 重慶：西南大學(xué)，2011.

[21]高巍. 棉花響應(yīng)黃萎病菌分子機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究及HDTF1基因的功能鑒定[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[22]Coumans J，Poljak A，Raftery M J，et al. Analysis of cotton（Gossypium hirsutum） root proteomes during a compatible interaction with the black root rot fungus thielaviopsis basicola[J]. Proteomics，2009，9（2）：335-349.

[23]Meng Y Y，Liu F，Pang C Y，et al. Label-Free quantitative proteomics analysis of cotton leaf response to nitric oxide[J]. Journal of Proteome Research，2011，10（12）：5416-5432.