基于菌落形態(tài)、顯微特征、DNA條形碼三種策略鑒定僵蠶表面真菌＊

李紅霞，徐 清，張 帆，羅雪梅，蘆海生，劉春生，楊瑤珺

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 102488；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院 北京 100102）

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4-5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥體，具有息風(fēng)止痙、祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)的功效[1]。現(xiàn)代研究表明僵蠶具有療效高、活性強(qiáng)、臨床應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)，并且常年出口海外[2,3]。

近年來(lái)，中藥的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，中藥質(zhì)量問(wèn)題受到人們的關(guān)注。有報(bào)道稱中藥飲片表面存在真菌污染的情況，這已經(jīng)成為影響中藥質(zhì)量的主要因素之一。王文麗[4]對(duì)45份中藥飲片進(jìn)行檢測(cè)，其中的43份有真菌檢出，污染率達(dá)95%，曲霉屬真菌和青霉屬真菌為主要污染菌。秦筱茂[5]對(duì)9種常用中藥的藥用植物、個(gè)子貨藥材、飲片以及以其中7種藥材為主要原料的中成藥表面真菌污染情況進(jìn)行檢測(cè)，其中27份藥用植物樣品中分離出真菌354株，真菌污染率為96%，21份個(gè)子貨和中藥飲片中分離出7屬54株真菌，真菌污染率為90%。李閩真等[6]對(duì)福建省中藥材霉菌情況進(jìn)行調(diào)查，12種中藥材中檢測(cè)到霉菌10屬375540株，曲霉屬和青霉屬真菌為中藥材的主要污染菌。目前關(guān)于中藥表面真菌的研究主要集中在植物類中藥，動(dòng)物類中藥表面真菌的研究較少，未查閱到關(guān)于僵蠶表面真菌的研究。

本研究對(duì)北京市零售藥店收集的僵蠶飲片表面真菌進(jìn)行鑒定。采用平板法培養(yǎng)僵蠶表面真菌，頂端純化法對(duì)僵蠶表面真菌進(jìn)行純化，獲得單一菌株。觀察真菌菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)特征，初步對(duì)真菌進(jìn)行分類。提取真菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步確定真菌的種類，綜合三種方法共同鑒定僵蠶表面真菌。

1 材料

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（LS-B95型 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠）；OLYMPUS SXZ研究型體視顯微鏡（OLYMPUSBX51系統(tǒng)）；Gene Amp PCR System 9600 PCR擴(kuò)增儀；Thermo Cell恒溫金屬?。˙IOER公司）；SIGMA3K-15低溫高速離心機(jī)（德國(guó)SIGMA有限公司）；GRANT制冰機(jī)；QL-88B型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；THZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器（THZ-C-1太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

1.1.2 試劑

氨芐青霉素儲(chǔ)存液（100 mg·mL-1Coolaber公司）；甘油（Sigma-Aldrich公司）；乳酸酚棉藍(lán)染色液（上海源葉生物科技有限公司）；真菌基因組DNA快速提取試劑盒（Biomiga公司）；2×Bench top taq master mix；引物（Sangon Biotech公司）；無(wú)菌雙蒸水（上海源葉生物科技有限公司）

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Coolaber公司）

1.2 PCR引物

Primer 1：5-agaagtcgtaacaaggtttc-3，Primer 4：5-tcctccgcttattgatatgc-3

1.3 樣品

2017年5 月從北京市8家零售藥店收集僵蠶（蠶蛾科昆蟲家蠶Bombyx moriLinnaeus 4-5齡的幼蟲感染（或人工接種）白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuilknt而致死的干燥體）飲片。將收集的僵蠶飲片放入無(wú)菌自封袋內(nèi)，密封，4℃保存?zhèn)溆茫ū?）。

2 方法

2.1 制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基

取43 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基加水1000 mL，搖勻，121℃滅菌20 min。放涼至約50℃，加入氨芐青霉素儲(chǔ)存液100 μL（100 mg·mL-1），制備培養(yǎng)基約50個(gè)，放于冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 培養(yǎng)僵蠶表面真菌

取僵蠶樣品適量，采用震蕩方式洗下僵蠶表面的真菌。將樣品放置在搖床上，28℃、180 r·min-1震蕩30 min，震蕩結(jié)束后靜置5 min。采用平板法對(duì)僵蠶表面真菌進(jìn)行培養(yǎng)，取1 mL洗脫液接種于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù)。接種后的平板在28℃下，避光培養(yǎng)5天。

2.3 菌絲頂端純化法純化僵蠶表面真菌

5天后，取出培養(yǎng)基，觀察真菌的菌落形態(tài)，分別挑選形態(tài)不同的單一菌落，采用菌絲頂端純化法，接種到新的PDA培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基接種3個(gè)點(diǎn)，28℃下，避光培養(yǎng)5天。獲得單一菌株，用于觀察菌體在培養(yǎng)基中菌落形態(tài)與生長(zhǎng)情況。

2.4 依據(jù)菌落形態(tài)與顯微特征鑒定僵蠶表面真菌

取單一菌株，觀察平板內(nèi)菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地、直徑等。用解剖針取一小塊真菌，放于載玻片上，滴加乳酸酚棉藍(lán)染色液染色30 s，制片。放置于光學(xué)顯微鏡下，觀察真菌菌絲形態(tài)與顏色、孢子結(jié)構(gòu)特征、足細(xì)胞等。結(jié)合真菌菌落形態(tài)與顯微特征，依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》初步鑒定僵蠶表面真菌。

表1 中藥飲片僵蠶樣品信息表

2.5 依據(jù)DNA條形碼鑒定僵蠶表面真菌

根據(jù)真菌基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA。提取得到的真菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，體系包括：1 μL的DNA模板、1 μL的引物P 1、1 μL的引物P 4、10 μL的DNA聚合酶、加無(wú)菌水補(bǔ)充至20 μL。擴(kuò)增步驟如下：94℃預(yù)變性90 s，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)反應(yīng)30次，72℃5 min，4℃保持。PCR產(chǎn)物由上海生物工程股份有限公司測(cè)序，獲得DNA序列結(jié)果，輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步確定真菌種類。

3 結(jié)果

3.1 各批次僵蠶飲片表面所含真菌的數(shù)目及種類

分別對(duì)8個(gè)批次僵蠶飲片表面真菌進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，從樣品JC1中共分離得到5株真菌；樣品JC2中共分離得到96株真菌；樣品JC3中分離得到5株真菌；樣品JC4中分離得到14株真菌；樣品JC5中分離得到1株真菌；樣品JC6中分離得到2株真菌；樣品JC7中分離得到3株真菌；樣品JC8分離得到101株真菌。從僵蠶飲片表面共分離得到227株真菌。

3.2 僵蠶表面真菌菌落形態(tài)與顯微特征鑒定結(jié)果

圖1 僵蠶飲片表面真菌形態(tài)與顯微特征圖

依據(jù)真菌菌落形態(tài)，采用頂端純化法純化真菌，獲得單一菌株。根據(jù)真菌的菌落形態(tài)與顯微特征，初步將227株真菌分為10種（圖1）。結(jié)果顯示，青霉屬（Penicilliumsp.）真菌菌落圓形、邊緣整齊，多為灰綠色。顯微鏡鏡下可見(jiàn)菌絲、分生孢子梗具橫隔，光滑或粗糙。頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗經(jīng)過(guò)多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱或不對(duì)稱的小梗，形如掃帚，稱為帚狀體（Fig.9）。曲霉屬（Aspergillussp.）真菌菌落圓形、邊緣整齊，菌落邊緣白色，中間產(chǎn)生孢子呈黑色。分生孢子梗由一根直立的菌絲形成，菌絲的末端形成球狀膨脹（頂囊）（Fig.6）。黑曲霉（Aspergillus niger）菌落圓形，邊緣白色，中間黑褐色。菌絲發(fā)達(dá)，多分枝，為多細(xì)胞真菌。分生孢子梗從特化的菌絲細(xì)胞（足細(xì)胞）上垂直生出，分生孢子頭狀如“菊花”（Fig.4）。依據(jù)菌落形態(tài)與顯微特征初步鑒定僵蠶表面10種真菌中的曲霉屬真菌、青霉屬真菌、黑曲霉菌。

3.3 DNA條形碼鑒定結(jié)果

僵蠶飲片表面共分離得到227株10種真菌，提取菌株DNA，采用分子鑒定方法共鑒定得到8種真菌，8種真菌分別為溜曲霉（Aspergillus tamariiFig.2）、黃曲霉（Aspergillus flavusFig.3）、黑曲霉（Aspergillus nigerFig.4）、聚多曲霉（Aspergillus sydowiiFig.5）、曲霉屬真菌（Aspergillus sp.Fig.6）、Aspergillus jensenii（Fig.8）、青霉屬真菌（Penicilliumsp.Fig.9）、焦曲霉（Aspergillus calidoustusFig.10），其中2株真菌無(wú)法進(jìn)行鑒定（Fig.1、Fig.7）（表2）。Fig.3與Fig.6真菌的形態(tài)特征存在差異，顯微結(jié)構(gòu)相似，DNA條形碼測(cè)序結(jié)果同為曲霉屬真菌，F(xiàn)ig.3真菌可以鑒定到種，但Fig.6只能鑒定到屬?；谡婢木湫螒B(tài)、顯微結(jié)構(gòu)特征、DNA條形碼三種方法共同鑒定僵蠶表面真菌種類，初步了解北京市零售藥店僵蠶表面存在真菌的狀況，為研究僵蠶表面真菌提供參考依據(jù)。

3.4 小結(jié)

對(duì)僵蠶表面真菌進(jìn)行培養(yǎng)，共得到227株10種真菌。結(jié)合3種鑒定真菌的方法，10種真菌中的8種可以鑒定，分別為溜曲霉（Aspergillus tamarii）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、曲霉屬真菌（Aspergillus sp.）、Aspergillus jensenii、青霉屬真菌（Penicillium sp.）、焦曲霉（Aspergillus calidoustus），其它2種為未知菌株。

4 討論

4.1 僵蠶飲片表面真菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性與差異性分析

本研究結(jié)果顯示，JC2中分離得到96株真菌，JC8中分離得到101株真菌，其他6批中藥表面真菌的數(shù)目較少，可見(jiàn)，JC2與JC8真菌數(shù)目的統(tǒng)計(jì)結(jié)果與其他6個(gè)批次真菌數(shù)目存在差異較大，可能與僵蠶的來(lái)源有關(guān)，本研究中使用的僵蠶飲片收集于北京市不同的零售藥店，各藥店的貨源以及貯藏環(huán)境不同，并且，僵蠶是易霉變飲片，以上原因都可能導(dǎo)致僵蠶飲片表面真菌數(shù)目的不同。

本研究采用真菌菌落形態(tài)、真菌顯微結(jié)構(gòu)、DNA條形碼三種方法共同鑒定僵蠶飲片表面真菌。三種鑒定方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，真菌菌落形態(tài)與顯微結(jié)構(gòu)只能初步將真菌分類，其鑒定結(jié)果需要采用分子鑒定進(jìn)行進(jìn)一步的確認(rèn)。但是，DNA條形碼檢測(cè)結(jié)果存在一定偏差，如在PCR擴(kuò)增和測(cè)序過(guò)程中可能引入潛在的偏差；同時(shí)，測(cè)序結(jié)果需要輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)主要充當(dāng)歸檔文件，提交的許多序列存在標(biāo)注不正確或定義不明確的物種名稱。據(jù)估計(jì)超過(guò)10%的公開(kāi)可用真菌ITS序列在物種水平上的注釋不正確。此外，GenBank中的許多真菌ITS序列被注釋為“未鑒定真菌”。因此就需要綜合三種鑒定結(jié)果共同判斷真菌的種類，本研究中的2株未知真菌由于未得到PCR產(chǎn)物，因此未得到鑒定結(jié)果，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

表2 僵蠶表面真菌DNA檢測(cè)結(jié)果表

4.2 中藥表面真菌污染現(xiàn)狀及原因

中藥多來(lái)自于野生或種植養(yǎng)殖的動(dòng)植物，經(jīng)歷了生產(chǎn)、采收加工以及運(yùn)輸貯藏等多個(gè)環(huán)節(jié)，各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能污染真菌。陳娟等[7]對(duì)7種根類藥材中污染真菌進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，從7份根類藥材樣品中分離到6屬17種真菌，其中青霉屬真菌為主要污染菌，共有9個(gè)種，鐮刀菌屬3個(gè)種，曲霉屬2個(gè)種，其他屬3個(gè)種。宋美芳等[8]對(duì)云南省主產(chǎn)的3種中藥材上污染真菌進(jìn)行了研究，并對(duì)不同貯藏時(shí)間中藥材真菌菌株數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，說(shuō)明隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，中藥材表面真菌數(shù)量增加。在絞股藍(lán)[9]、六神曲[10]、三七[11]和草果[11]上同樣發(fā)現(xiàn)了真菌污染的情況。中藥污染真菌的原因主要分為外因與內(nèi)因，影響中藥表面真菌污染的外因主要包括：溫度、濕度、氧分壓、pH等。除此之外，內(nèi)部因素（營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)）也是影響真菌生長(zhǎng)的重要條件，如碳源、氮源、礦物鹽等等。中藥中含有大量的淀粉、糖、蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，能夠?yàn)檎婢L(zhǎng)提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在適宜的溫度、濕度、氧氣等條件下，真菌可利用中藥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行大量的繁殖[12]。僵蠶主要的活性成分為蛋白質(zhì)，可以為真菌生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，因此僵蠶表面真菌的生長(zhǎng)可能與其所含的化學(xué)成分有關(guān)。

4.3 研究中藥表面真菌意義

本研究從僵蠶表面分離得到真菌227株，共計(jì)10種。通過(guò)觀察真菌菌落形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、DNA條形碼共同鑒定得到8種真菌。張?chǎng)蔚萚13]從久貯陳皮中分離鑒定了25株真菌，分屬于2屬5種。該研究將黑曲霉返接種到無(wú)菌陳皮樣品中，培養(yǎng)檢測(cè)陳皮的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)黑曲霉代謝轉(zhuǎn)化與陳皮藥效物質(zhì)變化具有相關(guān)性，黑曲霉的代謝轉(zhuǎn)化促進(jìn)陳皮藥材藥效物質(zhì)積累增加。從真菌黑曲霉與宿主陳皮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)變化的角度闡明“陳久者良”科學(xué)內(nèi)涵[14]?？梢?jiàn)中藥表面真菌與中藥藥效存在一定的關(guān)系。但是，部分真菌產(chǎn)生的真菌毒素可能危害人體健康。有研究表明，真菌毒素與人體的某些慢性疾病、地方性疾病關(guān)系密切，部分真菌毒素甚至有致癌的可能[15]。真菌毒素由特定真菌產(chǎn)生，因此控制真菌生長(zhǎng)，對(duì)切斷真菌毒素的產(chǎn)生具有重要意義?？梢?jiàn)，研究真菌對(duì)保證安全用藥具有重要意義。