響應(yīng)面法優(yōu)化制黃精高壓蒸制工藝研究＊

宋藝君，郭 濤，馬存德，彭秀娟，劉世軍，王志彥，孫 靜，王昌利

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 咸陽 712046；2.解放軍第451醫(yī)院 西安 710054；3.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司 西安 710075；4.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 咸陽 712046）

黃精屬于百合科，其植物來源有滇黃精（PolygonatumkingianumColl.etHemsl.）、黃 精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）。黃精始載于《名醫(yī)別錄》，被列為上品。黃精為我國傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)中藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤(rùn)肺、益腎的功效[1]，主要用于脾胃氣虛、胃陰不足、精血不足、腰膝酸軟等證的治療。其[2-3]所含化學(xué)成分主要有多糖、甾體皂苷、蒽醌、氨基酸等，現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，黃精具有[4-5]抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、降血脂、降血糖、抗癌、提高和改善記憶、抗炎、抗病毒等作用。2015版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》收載了黑豆汁制黃精。生黃精具有刺人咽喉的副作用，經(jīng)過黑豆汁制后，一方面增強(qiáng)健脾益腎作用，另一方面可除去麻味，同時(shí)外觀顏色也由淡黃色或黃棕色變?yōu)樽睾稚梁谏?/p>

目前黃精的炮制多采用傳統(tǒng)的常壓蒸制工藝[6-8]，蒸制時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低，資源浪費(fèi)大，工藝參數(shù)不易控制，而高壓蒸制工藝[9,10]采用先進(jìn)設(shè)備，節(jié)省人力、物力資源，生產(chǎn)效率提高，使炮制參數(shù)得到控制，從而提高炮制品質(zhì)量。本研究

在文獻(xiàn)查閱和前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總皂苷、5-HMF、多糖、醇浸出物含量和飲片外觀性狀的總評(píng)歸一值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[11,12]，考察炮制壓力、悶潤(rùn)時(shí)間、炮制時(shí)間和黑豆用量4個(gè)因素，首次采用高壓蒸制工藝優(yōu)化黑豆汁制黃精炮制工藝，并將高壓蒸制品與常壓蒸制品進(jìn)行比較，以期尋找一種更好的炮制方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

LDZX型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；U3000型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（島津公司）；BT-25S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

圖1 5-HMF對(duì)照品（A）和高壓蒸制品（B）的HPLC圖

黃精采自陜西步長(zhǎng)制藥有限公司漢中基地，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院胡本祥教授鑒定為百合科植物黃精Polygonatum sibiricum Red.的干燥根莖。對(duì)照品5-HMF（批號(hào)111626-201711，純度99.2%）、葡萄糖（批號(hào)110833-201707，純度 99.9%）、人參皂苷 Rb1（批號(hào)110704-201625，純度95.0%）均購于中國食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖的定量測(cè)定[1]

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

取無水葡萄糖對(duì)照品33 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含無水葡萄糖0.33 mg）。

2.1.2 供試品溶液制備

取本品細(xì)粉0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，加熱回流1 h，濾過，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌（3次），每次10 mL，將殘?jiān)盀V紙放燒瓶中，加水150 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，殘?jiān)盁坑脽崴礈?次（每次10 mL），合并濾液與洗液，轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶中，稀釋定容。量取1 mL，置試管（10 mL）中，按2.1.3項(xiàng)下方法，自“加水至2.0 mL”起，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中含無水葡萄糖的重量（mg）。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

分別精密量取對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL試管中，各加水至2.0 mL，搖勻，放置冰水浴中，緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，搖勻，放冷后于水浴中保溫10 min，取出，立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在582 nm處測(cè)定吸光度。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程y=32.519x+0.6383，r=0.9993。線性范圍為0.0167-0.2001 mg。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液（響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)2號(hào)樣品），按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定y值，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD為0.05%，表明本方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)2號(hào)樣品），按2.1.3項(xiàng)下方法，分別在0、30、60、90、120 min測(cè)定y值，結(jié)果RSD為0.50%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品6份，每份0.25 g，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份量取1 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法測(cè)定y值，結(jié)果RSD為2.06%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知黃精多糖含量的樣品6份，每份0.25 g，分別加入等量葡萄糖對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定y值，結(jié)果平均回收率為98.79%，RSD為1.14%，表明本方法回收率良好。

2.2 5-HMF的定量測(cè)定[13]

2.2.1 色譜條件

Hypurity C18色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）,流動(dòng)相為甲醇-水（8∶92），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃。5-HMF對(duì)照品及高壓蒸制品的HPLC圖譜見圖1。結(jié)果表明，樣品中其它成分對(duì)5-HMF的測(cè)定無干擾。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱定5-HMF對(duì)照品適量，用甲醇溶解制成濃度為100 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。取上述5-HMF對(duì)照品1 mL，用甲醇稀釋定容至5 mL的容量瓶，得到20 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密稱定樣品（1-30號(hào)）約0.2 g，置錐形瓶中，加入80%甲醇25 mL，稱重，加熱回流1 h，放涼至常溫，再稱重，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即可。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取 2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別取 5、10、20、40、80 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=111.64X-0.4583，r=0.9999(n=5)，結(jié)果表明，5-HMF 在 0.1-1.6 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取5-HMF對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)6次進(jìn)樣，結(jié)果5-HMF峰面積的RSD為0.62%，表明本儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液（響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)2號(hào)樣品），分別在0、4、8、12、24 h測(cè)定，結(jié)果5-HMF峰面積的RSD為0.89%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品6份（響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)2號(hào)樣品），每份0.2 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后測(cè)定峰面積，結(jié)果5-HMF峰面積的RSD為1.02%，表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知5-HMF含量的樣品6份，每份0.2 g，分別加入一定量5-HMF對(duì)照品溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定峰面積，結(jié)果平均回收率為99.32%，RSD為1.41%，表明本方法回收率良好。

2.3 浸出物的定量測(cè)定

按照《中華人民共和國藥典》2015版第四部2201（浸出物測(cè)定熱浸法）項(xiàng)下依法測(cè)定醇溶性浸出物。

2.4 總皂苷的定量測(cè)定[14]

2.4.1 對(duì)照品溶液制備

取人參皂苷Rb15.11 mg，精密稱定，置容量瓶（10 mL）中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為0.511 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液制備

取黃精粉末1 g，精密稱定，加入15 mL 80%乙醇，超聲30 min（2次），合并濾液至50 mL容量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，搖勻。

2.4.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

取2.4.1，2.4.2項(xiàng)下所得對(duì)照品溶液240 μL、樣品溶液100 μL水浴蒸干，按2.4.4項(xiàng)下方法顯色，以不加樣品溶液的空白試劑作為空白對(duì)照，分別把上述對(duì)照品和樣品溶液在紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果均在550 nm處有最大吸收。故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)550 nm。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密吸取對(duì)照品溶液120、240、360、480、600 μL，置試管中，揮干溶劑，加入0.2 mL新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混合均勻，于60℃水浴加熱15 min，冰浴5 min，取出，加入冰醋酸5 mL，以只加空白溶劑同法操作作為空白對(duì)照，在550 nm處測(cè)定吸光度。以人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=70.429X+0.0217，r=0.9996，結(jié)果表明，總皂苷在61.32-306.60 μg與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.4.5 精密度試驗(yàn)

取人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液，按2.4.4項(xiàng)下方法測(cè)定A值，重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD為0.32%，表明本方法精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同－供試品溶液（響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)2號(hào)樣品），按2.4.4項(xiàng)下方法，分別在0、10，20、30、40 min測(cè)定A值，結(jié)果RSD為0.59%，表明供試品溶液在40 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品6份（響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)2號(hào)樣品），每份1 g，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每份精密吸取100 μL，按2.4.4項(xiàng)下方法測(cè)定A值，結(jié)果RSD為2.31%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知總皂苷含量的樣品6份，每份1 g，分別加入一定量人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定A值，結(jié)果平均回收率為97.52%，RSD為1.34%，表明本方法回收率良好。

2.5 外觀性狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

參照《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》（2015版）黃精性狀項(xiàng)下規(guī)定，確定評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2.6 制黃精的炮制[15]

2.6.1 常壓蒸制

取凈黃精，加入適量黑豆汁，拌勻，悶潤(rùn)，置蒸鍋內(nèi)蒸制，取出，稍晾，切厚片，干燥。

2.6.2 高壓蒸制

取凈黃精，加入適量黑豆汁，拌勻，悶潤(rùn)，置蒸汽滅菌器內(nèi)高壓蒸制，取出，稍晾，切厚片，干燥。

表1 制黃精感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.7 單因素實(shí)驗(yàn)確定各個(gè)因素水平

2.7.1 炮制壓力考察

稱取100 g黃精藥材，共5份，設(shè)定黑豆用量10%，悶潤(rùn)時(shí)間1 h，炮制時(shí)間60 min，考察炮制壓力0.1、0.125、0.15、0.175、0.2 Mpa對(duì)多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評(píng)分的總評(píng)歸一值的影響，結(jié)果OD值分別為0.5734、0.6470、0.7190、0.7412、0.7629?？梢婋S著炮制壓力的增加，OD值持續(xù)升高，尤其在0.1-0.15 Mpa，OD值增大顯著，故選擇0.1、0.2 Mpa為炮制壓力后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化范圍。

2.7.2 悶潤(rùn)時(shí)間考察

稱取100 g黃精藥材，共4份，設(shè)定炮制壓力0.15 Mpa，黑豆用量10%，炮制時(shí)間60 min，考察悶潤(rùn)時(shí)間0、30、60、120 min對(duì)多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評(píng)分的總評(píng)歸一值的影響，結(jié)果OD值分別為0.6407、0.6721、0.6542、0.6496?？芍娱L(zhǎng)悶潤(rùn)時(shí)間后，OD值先升高，后又在小范圍內(nèi)有所降低，故選擇0、120 min為悶潤(rùn)時(shí)間后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化范圍。

2.7.3 蒸制時(shí)間考察

稱取100 g黃精藥材，共5份，設(shè)定炮制壓力0.15 Mpa，黑豆用量10%，悶潤(rùn)時(shí)間1 h，考察蒸制時(shí)間40、50、60、70、80 min對(duì)多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評(píng)分的總評(píng)歸一值的影響，結(jié)果OD值分別為0.6430、0.7401、0.7690、0.7850、0.8121?？芍娱L(zhǎng)蒸制時(shí)間后，OD值一直升高，尤其在剛開始的10 min，升高顯著，故選擇40、80 min為蒸制時(shí)間后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化范圍。

2.7.4 輔料用量考察

稱取100 g黃精藥材，共4份，設(shè)定炮制壓力0.15 Mpa，炮制時(shí)間60 min，悶潤(rùn)時(shí)間1 h，考察不同黑豆用量5%、10%、15%、20%對(duì)多糖、總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評(píng)分的總評(píng)歸一值的影響，結(jié)果OD值分別為0.5430、0.6301、0.6750、0.7121?？芍黾雍诙褂昧亢螅琌D值一直升高，尤其在5%-10%范圍，升高顯著，故選擇5%、20%為黑豆用量后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化范圍。

2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化制黃精高壓蒸制工藝

2.8.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

取黃精藥材，放置于高壓蒸汽滅菌器中，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 7.0.0軟件，利用響應(yīng)面法[11]對(duì)制黃精的高壓蒸制工藝進(jìn)行優(yōu)化。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中，將炮制壓力(X1)、悶潤(rùn)時(shí)間(X2)、炮制時(shí)間 (X3)、黑豆用量 (X4)、設(shè)定為考察因素，按2、1、0、－1、－2的最高、高、中、低、最低5水平進(jìn)行編碼，以總皂苷、5-HMF、多糖、浸出物和外觀評(píng)分的OD值（Y）作為響應(yīng)值。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.8.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，結(jié)果Y與X1、X2、X3、X4的 多 項(xiàng) 式 方 程 為Y＝3.12943＋7.20667X1－0.028766X3－0.2225X4－0.58875X2－0.7052X1X4＋1.903×10?3X3X4＋0.0417X2X4＋4.77768 ×10?3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析見表3，當(dāng)P＜0.05為顯著項(xiàng)，P＜0.01為極顯著項(xiàng)。由表3可知，4個(gè)因素中，X2不顯著（P值=0.0759），其余因素為顯著項(xiàng)，其中X1的P值為0.0372，X3的P值為0.0119，X4的P值為0.0295，且顯著程度X3＞X4＞X1；2 次項(xiàng)為極顯著項(xiàng)（P＝0.0005），表明黑豆用量與響應(yīng)值并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互項(xiàng)X1X4、X3X4、X2X4的P值分別為 0.007、0.0041、0.002，表明考察因素X1和X4、X3和X4、X2和X4之間具有特別明顯的交互作用。模型整體顯著性很好（P＜0.0001），且失擬程度不顯著（P＝0.6904），即4個(gè)因素炮制壓力(X1)、悶潤(rùn)時(shí)間(X2)、炮制時(shí)間(X3)、黑豆用量(X4)、與OD值（Y）之間的變化關(guān)系能夠通過本模型較好反映，即本模型可用來對(duì)蒸制工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

按所得模型繪制4個(gè)因素的交互作用對(duì)制黃精高壓蒸制工藝影響的3D響應(yīng)面圖見圖2。由軟件得出制黃精高壓蒸制工藝為先將黃精加入8.75%黑豆，悶潤(rùn)1.5 h，在0.17 Mpa壓力下蒸制50 min，取出，放涼，切厚片，干燥，OD值為0.7880。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn)及工藝比較

根據(jù)最優(yōu)工藝篩選結(jié)果，結(jié)合實(shí)際情況，將最優(yōu)工藝調(diào)整為壓力0.17 Mpa、悶潤(rùn)時(shí)間1.5 h、炮制時(shí)間50 min、黑豆用量9%。該工藝經(jīng)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。根據(jù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，黃精經(jīng)蒸制后，總皂苷、5-HMF、浸出物含量和外觀評(píng)分均有一定程度的增加，多糖含量減少，與常壓蒸黃精比較，高壓蒸制品中總皂苷、5-HMF、多糖、浸出物含量和外觀評(píng)分均較高，表

明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝具有一定的穩(wěn)定性。

表2 高壓蒸黃精響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

圖2 4個(gè)因素交互作用的三維響應(yīng)面圖

表4 黃精生品及各炮制品的定量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

高壓蒸制是借助高溫和高壓的非常強(qiáng)的熱穿透作用，使藥材容易被蒸透，從而達(dá)到炮制的目的。本方法操作簡(jiǎn)單，方便控制溫度、壓力和時(shí)間，且省工省時(shí),節(jié)約能源，提高了工作效率，便于生產(chǎn)，已成為現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，高壓蒸制與常壓蒸制黃精相比，可最大程度保持總皂苷、多糖等有效成分的含量，可很大程度縮短炮制時(shí)間[16]，提示高壓蒸制法可能成為制黃精炮制的一種有效、快捷的新方法。

在總皂苷的測(cè)定中，有學(xué)者采用薯蕷皂苷元作為對(duì)照[17]，也有學(xué)者以人參皂苷Rb1[18]作為對(duì)照，本研究以人參皂苷Rb1為對(duì)照采用分光光度法測(cè)定總皂苷含量。在總皂苷供試品溶液的制備中，比較了回流法、超聲法和微波提取法，發(fā)現(xiàn)總皂苷含量加熱回流法＞超聲波法＞微波法，考慮到加熱回流法溫度高可能造成皂苷的破壞，而超聲法簡(jiǎn)便、高效、且溫度低，可有效保護(hù)皂苷不被破壞，故選擇超聲法提取總皂苷?？紤]到黃精總皂苷中既有極性較大的皂苷，也有極性較小的皂苷和皂苷元，所以提取溶劑極性需要慎重選擇，據(jù)預(yù)試結(jié)果，80%乙醇作為提取溶劑合適。

黃精因?yàn)楹写罅康亩嗵?，在加熱炮制時(shí)可能發(fā)生氨基酸類成分與還原糖類成分的美拉德反應(yīng)，從而產(chǎn)生5-羥甲基糠醛等反應(yīng)產(chǎn)物。目前，5-HMF的藥理作用仍存在爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為5-HMF能夠有效防治神經(jīng)退行性疾病、認(rèn)知損害和抗心肌缺血[19]，可改變血液流變學(xué)，抗氧化，增進(jìn)血紅細(xì)胞變性[20]，也有研究發(fā)現(xiàn)其具有刺激性（皮膚、黏膜、眼睛），可通過和人體蛋白結(jié)合而引起中毒，從而造成內(nèi)臟損害和橫紋肌麻痹，且具有潛在的生殖及遺傳毒性[21]。

5-HMF的抗氧化作用、防治神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知損害作用支持了黃精的抗氧化、避免缺氧的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、改善學(xué)習(xí)記憶能力的藥理作用，以上說明5-HMF對(duì)黃精的藥理作用具有一定的貢獻(xiàn)度，因此測(cè)定5-HMF在炮制過程中含量的變化情況對(duì)黃精的炮制工藝研究具有重要的價(jià)值。