甘草止咳藥效與其數(shù)字化顏色測量值的相關(guān)性分析＊

曹光昭，林相龍，俞越童，陳慧榮，閆永紅，鄒慧琴＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102；2.北京寶德潤生醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司 北京 100088）

自古以來甘草以外皮紅棕色、斷面黃白色者為佳，《本草經(jīng)集注》稱：“赤皮、斷理，看之堅(jiān)實(shí)者…最佳…”[1]，《新編中藥志》載：“甘草以皮細(xì)緊、色紅棕、斷面黃白色、粉性足者為佳”[2]，由此可見，從顏色的角度來講，表皮“赤皮”、“色紅棕”，斷面“黃白”為甘草質(zhì)優(yōu)的性狀評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，感官顏色對甘草質(zhì)量的鑒別至關(guān)重要。然而，描述顏色的語言存在一定的模糊性，例如：內(nèi)蒙甘草，外皮紅棕色、棕色或灰棕色；新疆甘草，外皮灰棕色或灰褐色；歐甘草，外皮灰棕色。三種甘草外皮都有灰棕色的描述，但是有品種、采集、加工、貯藏時(shí)間等條件的制約，這三種甘草的灰棕色怎樣去比較？同一種甘草的棕色和紅棕色；灰棕色和灰褐色又要怎樣區(qū)分？無法準(zhǔn)確的描述顏色真實(shí)情況，而且中藥色澤傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)鑒別依賴于中藥鑒定專家的感官評測，對鑒定者的要求較高，即使都是經(jīng)驗(yàn)豐富的專家，在對中藥材的主觀感受上也不盡相同，主觀性強(qiáng)，缺乏客觀量化指標(biāo)，造成了感官評價(jià)的不精確性[3,4]，這些問題僅靠老藥工、專家等少數(shù)人的經(jīng)驗(yàn)并不能完善的解決，而且這些制約了中藥的顏色在質(zhì)量評價(jià)中的作用。因此，很有必要結(jié)合對甘草顏色參數(shù)的測定，并對其進(jìn)行量化處理，將傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別轉(zhuǎn)化為可客觀、量化的智能化識別模式[5]，實(shí)現(xiàn)中藥辨色論質(zhì)簡單、快速、實(shí)用[4]。

為此本研究引入廣泛應(yīng)用于許多行業(yè)的顏色測量儀器來對甘草進(jìn)行顏色測定，得出定量描述的數(shù)值，為用數(shù)字化的顏色與質(zhì)量的相關(guān)性分析以及用定量的顏色數(shù)據(jù)來為甘草顏色定標(biāo)準(zhǔn)，從而快速的評價(jià)甘草的質(zhì)量打下基礎(chǔ)，為甘草顏色的數(shù)字化提供了保證。色度學(xué)是一門研究顏色計(jì)量的科學(xué)，其任務(wù)在于研究人眼顏色視覺的定性和定量規(guī)律及應(yīng)用。每個(gè)人的視覺并不完全一樣的。在正常視覺的群體中間，也有一定的差別。目前在色度學(xué)上為國際所引用的數(shù)據(jù)，是由在許多正常視覺人群中觀測得來的數(shù)據(jù)而得出的平均結(jié)果。本研究是采用分光測色計(jì)對樣品進(jìn)行測定，色度儀利用的是CIEL*a*b*色空間系統(tǒng)，該系統(tǒng)常用于計(jì)算物體表面色的色差[6]，它是利用L*，a*，b*三個(gè)不同的坐標(biāo)軸，指示顏色在幾何坐標(biāo)圖中的位置及代號，對測試樣品的顏色進(jìn)行客觀表征[5]，在這個(gè)色空間中明度L*，色度a*和b*3個(gè)坐標(biāo)軸互相垂直。a*和b*表示不同的色調(diào)方向，a*表示紅色，-a*表示綠色，+b*表示黃色，-b*表示藍(lán)色，顏色的明度由L*的百分?jǐn)?shù)來表示[7,8]，明度越大，越偏白；明度越小，越偏黑[9]。

L*：值越大明度越大，感覺越白；值越小明度越小，感覺越暗。

a*：表示紅綠方向，+a*表示紅方向，-a*表示藍(lán)方向。

b*：表示黃藍(lán)方向，+b*表示黃方向，-b*表示藍(lán)方向。

ΔE*ab={(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2}1/2:ΔE*ab為色差，通常認(rèn)為其小于或等于1時(shí)，人眼將無法分辨兩種顏色的差異。

甘草性味甘平，歸心肺脾胃經(jīng)，有補(bǔ)氣健脾、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效。甘草顏色往往與藥效有著密切的聯(lián)系，現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為甘草具有止咳[10-12]、抗?jié)僛13]、抗炎、解毒[14]、抗病毒解痙止痛、調(diào)節(jié)免疫功能，對糖尿病的并發(fā)癥有預(yù)防作用[15]。目前國內(nèi)對于止咳藥效報(bào)道相對較多，認(rèn)為甘草口服后能覆蓋在發(fā)炎的咽部粘膜上，緩和炎性刺激而鎮(zhèn)咳，并且能促進(jìn)咽部和支氣管粘膜分泌，使痰易于咳出，呈現(xiàn)祛痰鎮(zhèn)咳作用，而且該藥效較易量化。因此，本文選擇了甘草止咳這個(gè)的藥效指標(biāo)來進(jìn)行研究。中藥質(zhì)量評價(jià)方法由傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別到應(yīng)用現(xiàn)代理化分析技術(shù)鑒別，不斷的在更新、發(fā)展。目前的甘草質(zhì)量評價(jià)方法有產(chǎn)地評價(jià)、基源評價(jià)、性狀評價(jià)、形態(tài)組織學(xué)方法、化學(xué)成分含量測定方法、指紋圖譜等方法，但性狀評價(jià)從古到今被廣泛采用，至今依然是甘草藥材質(zhì)量評價(jià)重要的方法，尤其在甘草的性狀評價(jià)中，顏色的鑒別與質(zhì)量的好壞密切相關(guān)[16]。已經(jīng)有相關(guān)研究表明甘草顏色與內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)存在相關(guān)性[17]，故通過氨水引咳法對小鼠進(jìn)行干預(yù)，研究甘草斷面顏色與有效成分之間的關(guān)系，以探討顏色數(shù)字化值與中藥質(zhì)量評價(jià)的相關(guān)性，揭示傳統(tǒng)中藥材性狀鑒別的科學(xué)性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品和材料

甘草，2010年10月收集于內(nèi)蒙古杭錦旗、甘肅玉門野生及三年生栽培甘草，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)選取的四種甘草樣品依據(jù)傳統(tǒng)顏色性狀分類杭錦旗野生甘草被分在第一類，玉門野生甘草在第二類，杭錦旗三年生栽培甘草在第三類，而玉門三年栽培甘草在第四類，以人眼觀察，這四份樣品間顏色性狀差異明顯，通過樣品斷面顏色色差結(jié)果及樣品表皮顏色色差結(jié)果發(fā)現(xiàn)這四份樣品間斷面和表皮顏色間色差值均大于1，四份樣品能較為全面的代表不同類別的甘草品種，因此選取這四份樣品進(jìn)行甘草止咳藥效與其數(shù)字化顏色測量值的相關(guān)性分析（表1）。所有樣品均經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系閆永紅教授鑒定，確定為甘草G.uralensisFisch（表1）。

1.2 儀器

ZN-02小型粉碎機(jī)（北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司）；U-3010紫外可見分光光度計(jì)（日本日立公司）；402AI超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與藥品

氨水（分析純），汕頭市西隴化工股份有限公司生產(chǎn)。磷酸苯丙哌林片（一力咳），上海全宇生物科技遂平制藥有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，雌雄各半，體重18-20 g（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 甘草斷面顏色測量方法[9]

2.1.1 樣品制備

將甘草切成長約2 cm的小段，對甘草段施以壓力，令表皮脫落，將去皮的甘草段打粉，過3號篩，粉末置于自制玻璃測色皿中，蓋上石英鏡片，以測色皿中粉末不隨意晃動(dòng)為準(zhǔn)。

2.1.2 顏色測定條件

采用日立3010紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行測量，測量起止波長：380-780 nm；狹縫寬度：1 nm；照明光源：D65；視場選擇：10度視角；掃描速度：600 nm·min-1。

就這樣，尹愛群在兩個(gè)家之間周旋，格外謹(jǐn)慎了。晚上從不在外過夜，周末仍像以前那樣，陪妻子逛街看電影，晚上散步，拉著妻子的手，恩恩愛愛。他去揚(yáng)揚(yáng)那里的時(shí)間，改為上班時(shí)間了，他是一把手，誰約束他呢！反正揚(yáng)揚(yáng)不上班，二人大白天大部分時(shí)間就是賴在床上，盡情地做愛，之后裸著身體，貓著腰去廁所，之后看電視，再后就是品嘗揚(yáng)揚(yáng)的烹飪手藝。揚(yáng)揚(yáng)擅長廚藝，她讀的是職業(yè)學(xué)校烹飪專業(yè)。廚房里工具齊全，光刀具就十多把。其中一把又長又鋒利的尖刀，揚(yáng)揚(yáng)一直不知道什么用途。

2.1.3 精密度考察

杭錦旗野生樣品，按上述供試品制備方法制備供試品，連續(xù)測量5次。測量結(jié)果RSD均小于3%，結(jié)果間ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.09，色差低于人眼可變范圍（表2、表3）。表明結(jié)果穩(wěn)定。

2.1.4 穩(wěn)定性考察

隨機(jī)取杭錦旗野生樣品5份，按上述供試品制備方法制備供試品，分別進(jìn)行測量。測量結(jié)果顯示RSD均小于3%，結(jié)果間ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.52，色差低于人眼可變辨范圍（表4、表5）。表明結(jié)果穩(wěn)定。

2.2 提取液的制備

取甘草樣品50 g，稱定，加水浸泡1 h，文火煎煮提取兩次，每次加水250 mL。提取40 min。過濾，水浴濃縮至0.32 g·kg-1。放置冰箱中備用。

2.3 小鼠氨水引咳法

小鼠140只，雌雄各半，按性別體重分為14組，即空白組，陽性對照組（一力咳38 mg·kg-1）和四組甘草樣品各自大、中、小劑量組。每組10只（雌雄各半），每天給藥一次，連續(xù)給藥7天，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食不禁水16 h，末次給藥后30 min即開始測量，將小鼠放入帶自制蓋子的大燒杯中用超聲霧化器以恒定壓力勻速將25%氨水噴入燒杯中，霧化5 s，觀察記錄小鼠的咳嗽潛伏期（從噴入氨水到小鼠第一次咳嗽的時(shí)間）和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)（以小鼠腹肌收縮張大口為準(zhǔn)，有無咳嗽聲音均可）。

《中國藥典》中甘草人體推薦劑量上限為9 g，人體重按照70 kg計(jì)，則人體推薦劑量為0.128 g·kg-1。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)小鼠中劑量為人體等效劑量，根據(jù)FDA小鼠人體劑量換算中提供的折算系數(shù)12.3折算，小鼠中劑量約為1.6 g。另以中劑量的2倍，1/2倍設(shè)計(jì)高，低劑量組。本實(shí)驗(yàn)中大劑量為3.2 g·kg-1，中劑量為1.6 g·kg-1，小劑量為0.8 g·kg-1。

2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)方法

表2 精密度考察指標(biāo)值

表3 精密度考察色差結(jié)果

表4 穩(wěn)定性考察指標(biāo)值

表5 穩(wěn)定性考察色差結(jié)果

表6 斷面顏色測量指標(biāo)值

表7 甘草止咳作用結(jié)果

表8 止咳藥效與L*、a*、b*相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)果

3.1 按照2.1方法，對4批甘草樣品分別進(jìn)行顏色值的測量，分別測量L*、a*、b*的值，L*代表明度、a*為綠紅，b*為黃藍(lán)，每個(gè)樣品重復(fù)測定三遍，記錄顏色指標(biāo)的平均值（表6）。

表6結(jié)果表明，從斷面顏色看，眼觀為黃色的樣品相應(yīng)的明度值L*值偏小，顏色偏暗；+b*值偏大，顏色偏黃。因此斷面顏色測量值同斷面?zhèn)鹘y(tǒng)性狀分類進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)斷面顏色測量結(jié)果同人眼觀察斷面顏色存在一致性。結(jié)果表明甘草斷面可以量化，并且量化結(jié)果能夠反映顏色的真實(shí)情況。

3.2 計(jì)算止咳率，止咳率（%）=實(shí)驗(yàn)組咳嗽潛伏期/空白組咳嗽潛伏期×100%（表7）。

表3結(jié)果表明，陽性對照組小鼠咳嗽潛伏期時(shí)間延長，2分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)降低。與空白對照組比較差異有顯著性意義（P＜0.01）。杭錦旗野生甘草，玉門野生甘草大劑量組小鼠咳嗽潛伏期時(shí)間均有延長，2分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)均有不同程度降低。與空白對照組比較有顯著差異（P＜0.01）。其余各組樣品咳嗽潛伏期同空白組比較沒有顯著性意義，但是2分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)均有不同程度降低，與空白對照組比較存在顯著差異。只有玉門小劑量組2分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)同空白組比較不存在顯著性意義。從2分鐘內(nèi)咳嗽次數(shù)降低程度來看，各組甘草樣品大劑量組＞中劑量組＞小劑量組。大劑量組間比較，野生甘草明顯優(yōu)于人工栽培甘草。中劑量組和小劑量組中，野生甘草和栽培甘草差別不明顯。

3.3 將甘草止咳藥效分別與顏色指標(biāo)值L*、a*、b*相關(guān)聯(lián)，使用SAS軟件做相關(guān)分析，結(jié)果見表8。

表4結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)指標(biāo)值L*、a*和甘草止咳作用之間不存在顯著相關(guān)，說明指標(biāo)值L*、a*和止咳作用之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)不出量效關(guān)系。指標(biāo)值b*和止咳作用之間存在顯著相關(guān)，說明b*和止咳作用之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即在一定程度上，b*值增大，止咳作用效果增加。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對4份樣品的斷面顏色進(jìn)行了測量，并對4份樣品進(jìn)行了藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明傳統(tǒng)性狀顏色分類結(jié)果中質(zhì)量較優(yōu)的樣品止咳作用＞質(zhì)量一般＞質(zhì)量較差。將止咳作用結(jié)果同顏色測量結(jié)果結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)四種樣品斷面顏色L*值和a*值存在差異，兩份野生甘草樣品的b*值大于栽培甘草樣品，在大劑量組間，野生甘草藥效優(yōu)于栽培甘草，而且b*值較大的杭錦旗野生甘草藥效優(yōu)于玉門野生甘草，推測甘草斷面顏色b*值增大，止咳作用效果增加。相同產(chǎn)地的樣品，有L*值降低，a*值上升，止咳作用越好的趨勢，且顏色性狀鑒別認(rèn)為質(zhì)量較優(yōu)的樣品止咳作用也較好。甘草樣品存在斷面顏色越黃，止咳作用越好的趨勢。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，野生甘草效果優(yōu)于人工栽培甘草，但具體的止咳機(jī)理尚不明確。野生甘草同人工栽培甘草在有效組分含量及組分比例方面均存在較大差異，但是止咳機(jī)理有待于進(jìn)一步深入研究。上述結(jié)論也表明了將人工栽培甘草完全取代野生甘草還存在一些問題亟待解決。同種甘草劑量不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著差異，說明存在一定的量效關(guān)系，有待于進(jìn)一步深入研究。

本文結(jié)合顏色測量結(jié)果初步嘗試分析了甘草斷面顏色同止咳作用的相關(guān)性。結(jié)果表明，甘草斷面顏色同止咳作用存在一定相關(guān)性，甘草顏色斷面與顏色指標(biāo)值b*聯(lián)系密切，色度計(jì)的應(yīng)用說明可以使甘草顏色數(shù)字化，并通過顏色數(shù)字化信息推斷甘草顏色越黃，止咳作用越好的趨勢，為甘草顏色的測量提供了支持，為將色度測定方法推廣應(yīng)用于其他藥材的顏色測量提供理論依據(jù)。為完善中藥性狀鑒別提供了參考，推動(dòng)了傳統(tǒng)學(xué)科的發(fā)展創(chuàng)新。