硅對(duì)鹽脅迫下甘草非藥用部位總黃酮、總皂苷積累動(dòng)態(tài)的影響＊

王建寰，張文晉，郎多勇，解植彩，張新慧,2＊＊

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 銀川 750004；2.寧夏回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心/寧夏回醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心/回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 銀川 750004）

甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）為豆科甘草屬多年生草本植物，是世界自然基金會(huì)全球14個(gè)重點(diǎn)保護(hù)物種之一，也是我國2000多種中藥中用量最大的一味藥材[1]。甘草以干燥的根和根莖入藥，具有清熱解毒、潤肺止咳、調(diào)和諸藥等功效，素有“眾藥之王”、“十方九草”等美譽(yù)[2]。甘草中的有效成分主要為黃酮類、皂苷類、多糖類物質(zhì)[3]。甘草的供應(yīng)長期以野生資源為主，過度采挖使得其野生資源嚴(yán)重匱乏，1984年國務(wù)院頒布了禁挖甘草的禁令，甘草成為了國家重點(diǎn)專控藥材。隨著甘草野生資源日益枯竭及現(xiàn)代社會(huì)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的加強(qiáng)，栽培甘草越來越成為甘草原料的重要來源。一般而言，栽培甘草生長周期為3-4年，每年可產(chǎn)大量甘草莖、葉資源[4]。但是，栽培甘草莖、葉多在秋季采割作牧草儲(chǔ)備，且對(duì)甘草藥理作用的研究主要集中在地下部位[4]。因此，合理開發(fā)利用甘草地上非藥用部位資源，契合當(dāng)下生態(tài)文明建設(shè)要求及循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展需求，必將成為甘草研究的熱點(diǎn)之一。

同一藥用植物的不同部位，由于不同的性狀特點(diǎn)及主要成分積累分布質(zhì)與量的差異，導(dǎo)致不同藥用部位藥理作用有一定差異，從而產(chǎn)生了中藥使用中普遍存在的“一體多用性”現(xiàn)象，這也是擴(kuò)大藥用部位、發(fā)現(xiàn)新藥源、綜合利用藥物資源的重要途徑。研究表明甘草葉中總黃酮能誘導(dǎo)腹腔和骨髓巨噬細(xì)胞產(chǎn)生具有殺傷作用的細(xì)胞毒因子[5]，并且能夠抑制胃酸分泌過多[6]和膠原蛋白誘導(dǎo)及二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集，具有較大的開發(fā)潛力[5]。

此外，栽培甘草主要分布在我國西北的鹽漬化地區(qū)[7]。研究表明鹽脅迫對(duì)甘草生長有一定的抑制作用。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到50 mmol/L或0.3%時(shí)就會(huì)顯著抑制甘草幼苗或二年生移栽苗的生長，且這種抑制作用具有濃度效應(yīng)[8,9]。目前土壤鹽漬化已成為困擾甘草栽培的重大問題之一，因此，合理開發(fā)利用鹽漬化地區(qū)的栽培甘草也成為目前研究的熱點(diǎn)。

硅是植物生長發(fā)育的有益元素，也是一種環(huán)境友好型元素[10]，盡管它能否被認(rèn)定為植物生長發(fā)育的必需元素仍然存在較大爭議，但是近年來大量研究表明，外源硅既能促進(jìn)植物生長發(fā)育，也可以降低鹽脅迫對(duì)植物的傷害，提高植物對(duì)鹽脅迫的抗性[11]。但鮮有外源硅對(duì)鹽脅迫下藥用植物非藥用部位活性成分的相關(guān)研究。

因此，本文研究了硅對(duì)鹽脅迫下甘草非藥用部位主要有效成分（總黃酮、總皂苷）積累動(dòng)態(tài)的影響效應(yīng)，探討鹽脅迫下不同濃度外源硅對(duì)甘草莖、葉中總黃酮、總皂苷的年積累動(dòng)態(tài)規(guī)律，為更好地開發(fā)利用甘草地上部位資源，提高甘草非藥用部位有效成分、選擇適宜的甘草莖葉采收期，合理進(jìn)行甘草地上部莖、葉資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)用甘草材料為一年生甘草幼苗，采自寧夏鹽池縣甘草種植基地，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院張新慧教授鑒定為甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）。蘆?。ㄅ?hào)120927，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）；甘草苷（批號(hào)13020901，成都曼思特生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的培養(yǎng)

在通風(fēng)、光照良好的室外開展盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)鹽脅迫水平，鹽基采用NaCl，濃度為6 g·kg-1風(fēng)干土，硅源采用K2SiO3，濃度分別為風(fēng)干土重的0、0.2、0.4、0.6 g SiO2/kg，共計(jì)4個(gè)處理組合。每盆裝風(fēng)干土20 kg，風(fēng)干土有機(jī)質(zhì)含量為0.6217%，全氮0.0226%，速效磷10.5159 mg·kg-1，有效鉀107.5697 mg/kg。裝土?xí)r將NaCl和K2SiO3與土壤充分混合，試驗(yàn)中因加入K2SiO3引入的K+，用KCl來維持K+濃度的一致。將同時(shí)育苗、管理一致、長勢一致的甘草苗根長修剪為20 cm，移栽于試驗(yàn)盆中，每盆10株。盆栽試驗(yàn)的管理措施與當(dāng)?shù)卮筇锕芾硪恢隆?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)材料的收集

7月至9月中旬，每隔30 d采集整株甘草，并分為主根、莖、葉部位，分別經(jīng)烘干、粉碎、過篩后備用。對(duì)不同采樣期的甘草莖、葉分別測定其總黃酮、總皂苷含量，進(jìn)行動(dòng)態(tài)積累考察。

1.3 總黃酮含量的測定

1.3.1 總黃酮的提取

精密稱取甘草干燥莖、葉粉末約0.5000 g，置于25 mL容量瓶中，加入80%乙醇（含0.3%的氨水）定容，40℃超聲提取90 min，其上清液即為總黃酮提取液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定蘆丁純品0.0100 g，用50%的乙醇超聲30 min溶解，搖勻，冷卻，定容至50 mL，得0.2 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照品溶液，冰箱中保存，備用。精密吸取上述蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別加入5%（g·L-1）NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min后加入0.3 mL的10%的硝酸鋁溶液，放置5 min，再加l mol·L-1NaOH 2 mL，用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置6 min。在353 nm測定其吸光度，以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制回歸曲線（圖1），求得回歸方程為：Y=5.0586X+0.0088（R2=0.9995），表示蘆丁在0.04-0.24 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3 樣品含量測定

吸取總黃酮提取液15 mL，分別加入5%（g·L-1）NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置5 min后加入0.3 mL的10%的硝酸鋁溶液，放置5 min，再加l mol·L-1NaOH 2 mL，用50%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，靜置6 min。在353 nm測定其吸光度，并計(jì)算相對(duì)樣品的含量（mg·kg-1）

1.3.4 方法學(xué)考察

取甘草葉粉末進(jìn)行方法學(xué)考察，精密度RSD值為1.23%；重復(fù)性RSD值為0.93%；加樣回收率96.23%，RSD值為1.87%；樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4 總皂苷含量的測定

1.4.1 總皂苷的提取

精密稱取甘草干燥莖、葉粉末約0.1000 g放置于10 mL帶刻度試管中，加10 mL甲醇，超聲40 min，離心3 min（3500 r·min-1），取其上清液，并用甲醇定容至10 mL，作為總皂苷提取液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取人參皂苷Re對(duì)照品0.0026 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，配置成濃度為0.26 mg·mL-1的人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為對(duì)照品貯備液，冰箱中保存，備用。精密吸取人參皂苷Re對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL的具塞試管中，水浴蒸干溶劑，再依次加5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL搖勻后，加入60%H2SO4溶液5 mL，混勻，在60℃水浴加熱20 min，立即以冰水冷卻，選用甲醇為空白對(duì)照，在523 nm測甘草樣品的總皂苷含量。以人參皂苷Re含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制回歸曲線（圖2），求得回歸方程為：Y=3.1407X+0.0047（R2=0.9942），表示人參皂苷Re在0-0.260 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.3 樣品含量測定

分別吸取制備好的根、莖、葉樣品溶液1ml，加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，搖勻后加入60%H2SO4溶液5 mL，混勻，在60℃水浴加熱20 min，立即以冰水冷卻，冷卻到室溫后，加入2 mL冰乙酸，523 nm處測定吸光度值，并計(jì)算相對(duì)樣品的含量（mg·kg-1）。

1.4.4 方法學(xué)考察

精密度RSD值為1.45%；重復(fù)性RSD值為1.78%；加樣回收率為98.45%，RSD值為2.33%；樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，方差分析多重比較用Duncan法（P＜0.05）；采用Excel 2003作圖。各圖中的數(shù)據(jù)均為6次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 硅對(duì)鹽脅迫下甘草莖、葉中總黃酮積累動(dòng)態(tài)的影響

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)曲線

甘草莖中總黃酮含量在采樣期內(nèi)呈“V”字型變化，先逐漸降低，在8月達(dá)到最小值，而后略有增加；葉中總黃酮含量在采樣期內(nèi)呈倒“V”字型變化，在8月底達(dá)到最大值（圖3）。從整個(gè)采樣周期內(nèi)甘草不同器官總黃酮含量變化來看，葉中總黃酮含量遠(yuǎn)高于莖。與鹽脅迫對(duì)照相比，加入不同濃度硅使7、9月份甘草莖中總黃酮含量明顯增加；而硅處理顯著增加了9月份甘草葉中總黃酮含量且以0.4 g·kg-1和0.6 g·kg-1硅濃度的作用最為明顯。

2.2 硅對(duì)鹽脅迫下甘草莖、葉中總皂苷積累動(dòng)態(tài)的影響

甘草莖中總皂苷含量在整個(gè)采樣期呈倒“V”字型變化，先逐漸升高，而后在9月達(dá)到最小值；葉中總皂苷含量在整個(gè)采樣期呈遞減趨勢，在9月底達(dá)到最小值（圖4）。從整個(gè)采樣期甘草莖、葉總皂苷含量變化來看，葉中總皂苷含量明顯高于莖。與鹽脅迫對(duì)照相比，0.6 g·kg-1硅處理顯著增加了7、9月份甘草莖中總皂苷含量卻顯著降低了8月份甘草莖中總皂苷含量。而加入不同濃度硅使8、9月份甘草葉中總皂苷含量明顯增加；只有0.6 g·kg-1硅處理顯著增加了7月份甘草葉中總皂苷含量而0.2 g·kg-1、0.4 g·kg-1硅處理使甘草葉中總皂苷含量明顯降低。

圖3 硅對(duì)鹽脅迫下甘草莖、葉中總黃酮積累動(dòng)態(tài)的影響

圖4 硅對(duì)鹽脅迫下甘草莖、葉中總皂苷積累動(dòng)態(tài)的影響

3 討論

藥用植物的有效成分在其體內(nèi)的合成與積累是其自身與一定的生長環(huán)境長期選擇的結(jié)果，外界環(huán)境在很大程度上影響著藥材的產(chǎn)量、質(zhì)量，且對(duì)不同時(shí)期[12]、不同部位[5]的影響效應(yīng)不同。而甘草的生長區(qū)以鹽漬化土壤為主，因此，鹽脅迫成為了影響甘草生長和有效成分積累[13]的一個(gè)重要的因素。研究表明，外源硅可以影響藥用植物在鹽脅迫條件下的次生代謝[14]，從而影響其活性成分的含量。由于甘草藥材中含有多種有效成分，不同濃度外源硅對(duì)鹽脅迫下不同部位、不同時(shí)期、不同有效成分的影響可能也不盡相同。

本研究發(fā)現(xiàn)外源硅能夠在一定程度上提高鹽脅迫下甘草莖、葉中總黃酮、總皂苷含量且這種提高效應(yīng)因硅濃度、脅迫時(shí)間和不同部位而異。與鹽脅迫對(duì)照相比，加硅處理明顯提高了7、9月份甘草莖、葉中總黃酮含量（圖3），且以0.4 g·kg-1和0.6 g·kg-1硅的作用最為明顯。與鹽脅迫對(duì)照相比，0.6 g·kg-1硅處理顯著增加了7、9月份甘草莖中總皂苷含量和7、8、9月份甘草葉中總皂苷含量（圖4）。由此可見，0.6 g/kg硅對(duì)鹽脅迫下甘草7、9月份莖、葉中總黃酮、總皂苷積累的促進(jìn)效應(yīng)最為顯著。這可能是由于硅能進(jìn)一步提高7月份甘草葉片的光合能力，促進(jìn)其初生代謝和次生代謝，從而在甘草莖、葉中產(chǎn)生并積累了較多的黃酮類、皂苷類成分。而到8月份，隨著氣溫的降低甘草生長減緩[5]，此時(shí)期甘草本身已經(jīng)在莖、葉部位積累了較多的黃酮類、皂苷類成分，使莖、葉中的總黃酮、總皂苷含量達(dá)到較大值，此時(shí)硅的效益相對(duì)較弱。而到了9月份，甘草的葉片開始脫落、地上莖逐漸干枯，地上部分的總皂苷含量降到了全年的最低點(diǎn)，可能與更多皂苷類物質(zhì)通過莖的運(yùn)輸?shù)搅说叵虏抠A存，進(jìn)而導(dǎo)致莖、葉中含量降低有關(guān)[15]；而甘草莖、葉中總黃酮積累趨勢卻在9月份略有上升，說明次生代謝產(chǎn)物之間可能有物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化的關(guān)系[15]。外源硅的加入在一定程度上提高了9月甘草莖、葉中總黃酮、總皂苷含量。

本研究表明，在整個(gè)生長期，甘草葉是總黃酮、總皂苷含量最高的器官，莖中有效成分的含量相對(duì)較少。甘草作為多年生草本植物，每年可獲得大量莖葉資源。然而，目前甘草莖、葉多作為牧草使用，其綜合利用率低下。本研究認(rèn)為，以外源硅提高不同時(shí)期甘草莖、葉總黃酮、總皂苷含量為基礎(chǔ)，在不影響根中藥效成分積累的前提下，選擇適宜季節(jié)、根據(jù)不同需要、結(jié)合產(chǎn)地的地域和氣候特點(diǎn)采收，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)甘草莖、葉藥用資源的有效開發(fā)利用。具體而言，7月是甘草的旺盛生長期，人工栽培的甘草可以通過夏季修剪（剪秧）調(diào)整植株長勢，一方面可以獲得一部分莖葉資源，另一方面可以改善通風(fēng)透光條件，提高葉片光合作用也利于光合產(chǎn)物積累，集中營養(yǎng)，提高藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量；9月可以結(jié)合甘草藥材采收，可將地上部分莖、葉資源進(jìn)行深度開發(fā)利用，進(jìn)行活性成分提取，從中尋找可替代根部所含有效成分或前體化合物，對(duì)其進(jìn)行加工、改造，使甘草地上資源得到更合理更深入的開發(fā)和應(yīng)用。這不僅可使甘草資源得到充分利用，提高藥農(nóng)種植甘草的積極性，又具有很高的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。