清腸溫中方促進(jìn)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸claudin-l、claudin-4表達(dá)修復(fù)腸黏膜屏障的機(jī)制研究＊

毛堂友，裴文靜，史 瑞，趙興杰，王志斌，陳曉偉，陳 晨，

石 磊，譚 祥，孫中美，丁龐華，李軍祥＊＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科 100078北京）

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的兩種形式之一，主要發(fā)生于結(jié)腸和直腸[1]，好發(fā)于年輕人，其腹痛、腹瀉、黏液膿血便等臨床癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[2]，也是目前消化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。UC病程遷延不愈，復(fù)發(fā)率相當(dāng)高，UC的嚴(yán)重并發(fā)癥——UC相關(guān)性結(jié)直腸癌的檢出率明顯升高，占UC患者死亡原因的10%-15%[3]。UC的發(fā)病率和患病率與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展程度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，主要見于北美和歐洲等發(fā)達(dá)國家。研究[4]顯示，北美地區(qū)UC的發(fā)病率約為37.5-248.6/10萬人/年，歐洲地區(qū)約為4.9-505/10萬人/年。亞洲UC患者病率及患病率較西方國家低，但近20年來呈逐年增加趨勢，尤其是日本、南韓、新加坡等[5]，Prideaux等[6]調(diào)查顯示，目前UC的發(fā)病率約為7.6-14.3/10萬/年，患病率為2.3-63.6/10萬/年。目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究顯示[7]，緊密連接蛋白的異常表達(dá)，從而直接影響腸黏膜屏障功能，是造成潰瘍性結(jié)腸炎的重要發(fā)病機(jī)制。本課題組前期研究[8,9]發(fā)現(xiàn)，清腸溫中方能夠明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床癥狀，抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)腸粘膜損傷，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究將從腸黏膜屏障緊密連接蛋白claudin-1和claudin-4入手，進(jìn)一步探討清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD雄性大鼠（200±20）g，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0004），飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。12小時(shí)光照/黑夜循環(huán)，溫度（20-24）℃，濕度50-60%；自由飲食飲水飼養(yǎng)。

1.2 藥物

美沙拉嗪腸溶片（mesalazine）購自德國Losan Pharma GmbH公司。清腸溫中方（黃連6 g，炮姜10 g，三七6 g，青黛6 g，地榆炭15 g，苦參15 g，木香6 g，炙甘草6 g）購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房。

1.3 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉（MW36-50KDa；MP Biomedical,Burlingame,CA,USA）,便潛血試紙（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；NF-κB抗體（abcam，Ab16502），Claudin-1抗體（abcam，Ab15098），Claudin-4抗體（Santa cruz，Sc-376643），Beta actin抗體（中杉金橋，TA-09）。

1.4 分組、造模及標(biāo)本采集

動(dòng)物模型的建立方法如前期研究[5]，概述如下：自由飲用4.5%DSS溶液制備大鼠UC模型，將60只健康SPF級(jí)雄性SD大鼠（體重200±20 g）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以4.5%DSS(MW：36000-50000，MP Biomedical)溶液自由飲水7天，普通飼料喂養(yǎng)，同時(shí)運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)均等分為分為6組：正常組，模型組，清腸溫中方低劑量組、中劑量組、高劑量組，美沙拉嗪組。自由飲用4.5%DSS溶液的同時(shí)，各組均以相應(yīng)藥物灌胃治療7天。每日稱取大鼠體重，觀察大便性狀，檢測便潛血，干預(yù)結(jié)束后，禁食不禁水24 h后取材，分離遠(yuǎn)端結(jié)腸10 cm，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Real time-PCR檢測結(jié)腸Claudin-1、Claudin-4基因表達(dá)

提取結(jié)腸組織樣本的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Claudin-1上游引物CACTTCCAGACTCCAC?CACC，下游引物 AATCTTCCATTGGGGCAGGG，擴(kuò)增片段長度275bp；Claudin-4上游引物AGCAATGACT?GGGGCCTTAC，下游引物 CCTAGCACTCCCCAAAC?CAG，擴(kuò)增片段長度115 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物 TTTAATGT?CACGCACGATTTC，擴(kuò)增片段長度150 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，各種統(tǒng)計(jì)2一△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，計(jì)算Claudin-1、Claudin-4值。

1.6 Western blot檢測結(jié)腸Claudin-1、Claudin-4蛋白表達(dá)

將結(jié)腸組織裂解后，離心取上清液，置于BSA標(biāo)準(zhǔn)液中，檢測樣品蛋白含量。調(diào)整濃度后，進(jìn)行電泳分離，分別加入claudin-1和claudin-4一抗以及二抗，漂洗后顯影、定影，圖像分析。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)腸NF-κB p65的表達(dá)

結(jié)腸組織石蠟切片（4 μm）經(jīng)過酒精脫水、二甲苯脫蠟、抗原修復(fù)、封閉后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色（NF-κB p65抗體濃度1∶2000，Beta actin抗體濃度1∶1000），以PBS為陰性對(duì)照，200倍鏡視野下采集圖片，image pro plus 6.0軟件分析圖像，計(jì)算光密度(IOD)和染色區(qū)域總面積（area），用平均光密度（IOD/area）來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件（IBM Corp,Armonk,NY,USA）分析，符合正態(tài)分布且方差齊進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），不符合正態(tài)分布或方差不齊進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，均為組間比較，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-1的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸claudin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸claudin-1的mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），清腸溫中方各劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸claudin-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。見表1，圖1。

2.2 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-4的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸結(jié)腸claudin-4的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的claudin-4的mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）。見表2、圖2。

2.3 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸NF-κB p65的影響

NF-κBp65在正常組大鼠結(jié)腸組織中的陽性表達(dá)很少或幾乎沒有表達(dá)。在模型組及各治療組中，主要可見于病變結(jié)腸粘膜組織的腸黏膜層、黏膜肌層、肌層、漿膜層，而各治療組較模型組的表達(dá)相對(duì)較少，其組織切片陽性表達(dá)染色主要為深棕黃色或褐色，圖3。

表1 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-1的影響（）

表1 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-1的影響（）

組別正常組模型組清腸溫中方低劑量組清腸溫中方中劑量組清腸溫中方高劑量組美沙拉嗪組n 10 10 10 10 10 10 claudin-1mRNA 1.67±0.54 0.86±0.23##1.09±0.62 1.17±0.24*1.31±0.32*1.28±0.38*claudin-1蛋白0.42±0.04 0.14±0.07##0.24±0.08*0.29±0.05*0.31±0.02*0.35±0.04*

圖1 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-1蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組NF-κBp65的平均光密度明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的NF-κB p65平均光密度顯著降低（P＜0.05），見表3。

表2 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-4的影響（）

表2 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-4的影響（）

組別正常組模型組清腸溫中方低劑量組清腸溫中方中劑量組清腸溫中方高劑量組美沙拉嗪組n 10 10 10 10 10 10 claudin-4mRNA 1.20±0.38 0.71±0.21#0.83±0.32 0.99±0.17*1.02±0.24*1.00±0.19*claudin-4蛋白0.42±0.04 0.14±0.07##0.24±0.08 0.30±0.04*0.31±0.02*0.35±0.04*

圖2 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠結(jié)腸claudin-4蛋白表達(dá)的影響

3 討論

圖3 清腸溫中方對(duì)UC大鼠結(jié)腸NF-κB p65蛋白的影響（IHC，×200）

UC的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，目前大多學(xué)者認(rèn)為持續(xù)腸道感染、腸黏膜屏障缺損、腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異常、遺傳和環(huán)境等因素共同參與了疾病發(fā)生過程，其中，腸黏膜屏障受損是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的關(guān)鍵因素[6]。腸黏膜屏障由機(jī)械屏障（腸黏膜上皮細(xì)胞）、化學(xué)屏障（黏膜表面黏液層+消化液等）、免疫屏障（相關(guān)淋巴組織細(xì)胞群和黏膜分泌的免疫球蛋白）和生物屏障（腸道菌群）等4個(gè)方面共同構(gòu)成[7]。機(jī)械屏障是機(jī)體防御的第一道防線，由腸黏膜上皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的連接組成，后者主要包括緊密連接（tight junction，TJ）、粘附連接（adherens junctions，AJ）和縫隙連接（gap junction，GJ），而其中TJ是腸上皮細(xì)胞間的主要連接方式，在維持腸上皮細(xì)胞極性和調(diào)節(jié)腸黏膜屏障的通透性中發(fā)揮著重要的作用。

TJ是由一系列蛋白、脂肪組成的復(fù)合體，連續(xù)地存在于細(xì)胞與細(xì)胞之間。TJ主要有兩大功能：一是“屏障功能”，即調(diào)節(jié)著離子、水分子、大分子甚至癌細(xì)胞的通路；二是“籬笆”功能，則主要與保持細(xì)胞極性有關(guān)，阻止在頂膜部位的分子與在側(cè)膜的分子相互混合[8]。因此，當(dāng)緊密連接的完整性受到破壞時(shí)，腸上皮緊密連接功能的缺失（又稱為“漏腸”），可引起腸上皮通透性增加[9,10]，腸道的細(xì)菌、病毒及其他微生物、物中的大分子蛋白等即可通過受損的緊密連接進(jìn)入機(jī)體，引起免疫反應(yīng)，引發(fā)一系列疾病，潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病也與此相關(guān)。緊密連接蛋白是TJ的主要組成部分，包括跨膜蛋白家族（claudin蛋白、occludin蛋白）、結(jié)腸黏膜扣帶蛋白（cingulin）、連接黏附分子（junctional adhe?sion molecules,JAMs）、膜周蛋白家族（zonula occlu?dins，ZOs）等結(jié)構(gòu)蛋白及各類連接蛋白分子，它們通過肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白II與細(xì)胞骨架相連[11,12]。緊密連接蛋白在維持腸黏膜屏障功能及調(diào)控細(xì)胞間通透性發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此，緊密連接蛋白的異常表達(dá)，則會(huì)直接影響腸黏膜屏障功能，這也是潰瘍性結(jié)腸炎的重要發(fā)病機(jī)制之一[13]。因此，尋求對(duì)腸上皮緊密連接具有保護(hù)作用的藥物，對(duì)治療潰瘍性結(jié)腸炎具有重要的意義。

Claudins蛋白是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白，是維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性關(guān)鍵蛋白。Claudin-1是最早分離出來的緊密連接蛋白，是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白之一，在維持腸粘膜上皮細(xì)胞屏障功能和緊密連接的完整性發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明[14]，Claudin-1的表達(dá)減少或結(jié)構(gòu)破壞時(shí)，可引起黏膜屏障功能紊亂，導(dǎo)致緊密連接功能失調(diào)和組織滲透性的增加，使得腸上皮細(xì)胞通透性增加，腸腔外源性抗原進(jìn)入，免疫反應(yīng)異常亢進(jìn)，從而促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。Claudin-4蛋白作為緊密連接蛋白家族成員之一，共有209個(gè)氨基酸組成，主要分布在肺、腎、腸和腦中，編碼基因定位于人類染色體7q11.23。Claudin-4蛋白一方面可以維持上皮細(xì)胞完整性，加強(qiáng)細(xì)胞間的連接，起到屏障作用，另一方面，在細(xì)胞頂端形成了緊密連接線，把上皮細(xì)胞質(zhì)膜分成頂側(cè)的脂質(zhì)部分和基側(cè)的蛋白部分，并阻止它們之間的相互彌散，以保持細(xì)胞的極性[15]。當(dāng)claudin-4蛋白表達(dá)減少時(shí)，可破壞緊密連接復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道黏膜屏障功能受損，進(jìn)而引起抗原移位、免疫損傷，促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生。另外，研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎與NF-κB密切相關(guān)[16,17]。當(dāng)機(jī)體受到脂多糖等外界刺激時(shí)，NF-κB會(huì)與IκB分離，進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控IL－6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，同時(shí)下調(diào)claudin-1、claudin-4等緊密連接蛋白的表達(dá)，造成腸黏膜屏障受損，促進(jìn)UC的發(fā)生發(fā)展[18,19]。

表3 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸NF-κB p65的影響（）

表3 清腸溫中方對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸NF-κB p65的影響（）

注：與正常組比較,##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

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本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠claudin-l、clau?din-4的基因和蛋白水平較正常組降低（P＜0.01，P＜0.05），提示提示DSS可抑制大鼠結(jié)腸黏膜緊密連接蛋白claudin-l、claudin-4的表達(dá)，而經(jīng)過清腸溫中方的干預(yù)后，結(jié)腸claudin-l、claudin-4的mRNA和蛋白水平均顯著升高（P＜0.05）。由此可以推測，清腸溫中方能夠通過上調(diào)claudin-l、claudin-4的表達(dá)，修復(fù)損傷的結(jié)腸黏膜屏障。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸NF-κB p65的平均光密度水平均顯著升高（P＜0.01）；而經(jīng)過清腸溫中方的治療后，中劑量組、高劑量組大鼠結(jié)腸NF-κB p65的平均光密度水平顯著降低（P＜0.05），由此說明，清腸溫中方可能是通過抑制NF-κB p65的表達(dá)，抑制腸道炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)緊密連接蛋白claudin-l、claudin-4的表達(dá)水平，修復(fù)腸粘膜損傷，達(dá)到治療UC的目的。清腸溫中方是本課題組李軍祥教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)而創(chuàng)立的經(jīng)驗(yàn)方，主要用于寒熱錯(cuò)雜、濕熱瘀阻證的潰瘍性結(jié)腸炎，主要由黃連6 g炮姜10 g三七6 g青黛6 g地榆炭15 g苦參15 g木香6 g炙甘草6 g等組成，其中黃連清熱利濕、厚腸止瀉，炮姜溫經(jīng)止血、健脾止瀉，二者合為君藥，一寒一溫，意在調(diào)和陰陽、平調(diào)寒熱；苦參清熱燥濕，青黛清熱解毒、涼血消斑，三七化瘀止血，三者共為臣藥，佐均藥清熱利濕，同時(shí)還可入營血，涼血、活血、止血；木香行氣止痛，地榆炭涼血止血、解毒斂瘡，二藥共為使藥，一氣一血，具有行氣止血的功效；炙甘草為使藥，調(diào)和諸藥，同時(shí)還具有補(bǔ)中益氣的作用。本方主要針對(duì)脾胃虛寒為本，濕熱瘀阻為標(biāo)的證型，其中“清腸”，即清利腸道濕熱，與本研究中下調(diào)NF-κB p65的表達(dá)而抑制腸道炎癥反應(yīng)相對(duì)應(yīng)；而“溫中”，即溫補(bǔ)中焦脾胃，增強(qiáng)衛(wèi)氣的防御功能，與本研究中清腸溫中方促進(jìn)緊密連接蛋白claudin-l、claudin-4的表達(dá)水平而修復(fù)腸粘膜損傷相類似。

本次研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了清腸溫中方通過抑制NF-κB p65、促進(jìn)claudin-l、claudin-4治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，但是其上下游的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，另外中藥的作用往往是網(wǎng)狀調(diào)控的，本研究所示的claudin-l、claudin-4是否是發(fā)揮作用的主要途徑？還有沒有其他通路，甚至是其主要作用的通路或者靶點(diǎn)？這些目前均不得而知。因此，下一步，我們需要深入研究相關(guān)的上下游靶點(diǎn)，并擴(kuò)充思路，深入研究腸道菌群、腸黏膜免疫等方向的研究，從而完善清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。