炎癥性腸病生物檢測(cè)器的構(gòu)建與調(diào)試

郭煒航，李帛軒，周浩宇，張辰，王宣，倪川

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炎癥性腸病生物檢測(cè)器的構(gòu)建與調(diào)試

郭煒航1*，李帛軒1*，周浩宇1*，張辰1，王宣2，倪川1

1 北京師范大學(xué)第二附屬中學(xué)，北京 100192 2 清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院與生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100084

郭煒航, 李帛軒, 周浩宇, 等. 炎癥性腸病生物檢測(cè)器的構(gòu)建與調(diào)試. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(12): 1906–1914.Guo WH, Li BX, Zhou HY, et al. Construction and characterization of a bio-detector for inflammatory bowel disease. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 1906–1914.

利用工程改造過(guò)的腸道微生物進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、便宜便捷的腸道炎癥檢測(cè)、治療可有效應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。腸道炎癥通常伴隨著腸道中硫代硫酸鹽和連四硫酸鹽的增加，雙組分系統(tǒng)ThsSR和TtrSR是兩套分別檢測(cè)這兩種小分子的生物感受器系統(tǒng)。采用熒光蛋白作為指示劑需要復(fù)雜的測(cè)試儀器，不適用于家用檢測(cè)環(huán)境，而肉眼可見(jiàn)的色素蛋白和有色小分子作為指示劑將可能擴(kuò)大ThsSR和TtrSR的應(yīng)用前景。兩套系統(tǒng)分別被轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10和益生菌.Nissle 1917中，sfGFP信號(hào)表達(dá)效果證明了這兩套系統(tǒng)可用。考慮實(shí)際應(yīng)用，sfGFP被一系列色素蛋白和顯色小分子替換，在.Top10中，一系列色素蛋白和紫色桿菌素前體protoviolaceinic acid的顯色效果明顯，表明了該系統(tǒng)具有用于實(shí)際腸道炎癥檢測(cè)的可行性。結(jié)果表明，改進(jìn)后的ThsSR和TtrSR系統(tǒng)能夠針對(duì)不同濃度的腸道炎癥標(biāo)記物作出相應(yīng)程度的反應(yīng)，具備用于家庭環(huán)境人體腸道炎癥檢測(cè)的潛力。

炎癥性腸病，硫代硫酸鹽，連四硫酸鹽，生物檢測(cè)器，色素蛋白，紫色桿菌素前體

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease) 包括克羅恩氏癥(Crohn’s disease，CD) 和潰瘍性腸炎(Ulcerative colitis，UC)，是一種慢性特發(fā)性腸道疾病。隨著炎癥性腸病的發(fā)病率日益增長(zhǎng)，我國(guó)對(duì)腸道炎癥的檢測(cè)效果仍面臨挑戰(zhàn)[1]。

在腸道炎癥中，存在于結(jié)腸中的硫酸鹽還原細(xì)菌將飲食和宿主的氧化硫物質(zhì)轉(zhuǎn)化為H2S分子。然而，由于生物體內(nèi)的H2S分子難以測(cè)量，試圖將H2S含量和腸道炎癥狀況直接聯(lián)系起來(lái)幾乎不可行[2]。而人的腸道黏膜會(huì)將過(guò)多的H2S轉(zhuǎn)化為硫代硫酸鹽[3]而去除毒性，從而使得硫代硫酸鹽成為腸道炎癥的一種潛在標(biāo)記物。而Winter等[4]發(fā)現(xiàn)，宿主體內(nèi)特定的生物過(guò)程還會(huì)產(chǎn)生氮氧自由基，將硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)化為連四硫酸鹽，從而促進(jìn)某些腸道炎癥細(xì)菌如鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)。因此硫代硫酸鹽和連四硫酸鹽的水平可能均與腸道炎癥程度相關(guān)。

近來(lái)，Daeffler和Galley等[5]在海洋中的希瓦氏菌屬sp內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ThsSR和TtrSR兩套雙組分檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能感應(yīng)硫代硫酸鹽和連四硫酸鹽這兩種分子，并激活后續(xù)基因的表達(dá)。Daeffler和Galley等將這兩套雙組分系統(tǒng)連接上報(bào)告基因綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)入大腸桿菌.Nissele 1917中，灌喂腸道炎癥小鼠模型[6]，之后在收集到的小鼠糞便分離出細(xì)菌，利用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的熒光強(qiáng)度，從而判斷小鼠的炎癥發(fā)生。由于綠色熒光蛋白需要氧氣成熟才能發(fā)出熒光，并且需要大型儀器，應(yīng)用于實(shí)際生活中會(huì)有所不便，因此我們選用色素蛋白或者其他有顏色的分子作為指示劑，便于使用者在家庭環(huán)境下就能夠通過(guò)觀察糞便顏色來(lái)判斷自身腸道炎癥狀況。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌.Top10購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌.Nissle 1917由Mr. Kai Sheng Hee、NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI) 實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。表達(dá)質(zhì)粒pSB4K5、pSB1C3從iGEM Foundation獲得。表達(dá)質(zhì)粒pSEVA321由Victor DeLorenzo實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，含綠色熒光蛋白基因、色素蛋白基因、紫色桿菌素前體基因的質(zhì)粒從iGEM Foundation獲得。使用了如下基因(基因展示規(guī)則為iGEM生物磚編號(hào)及該基因編碼的蛋白名稱)：

1. BBa_K1033910 “fwYellow yellow chromoprotein”

2. BBa_K1033916 “amajLime yellow-green chromoprotein”

3. BBa_K592010 “amilGFP yellow chromoprotein”

4. BBa_K1033919 “gfasPurple purple chromoprotein”

5. BBa_K1033932 “spisPink pink chromoprotein”

6. BBa_K592009 “amilCP blue chromoprotein”

7. BBa_K274003 "Vio operon ABDE”

8. BBa_I746916 "superfolder GFP”。

1.2 方法

1.2.1 ThsSR和TtrSR目的基因的獲得

ThsS、ThsR、TtrS、TtrR序列信息見(jiàn)iGEM parts registry[7-10]。通過(guò)蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，合成序列為大腸桿菌70依賴型持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-ThsS/TtrS-終止子(下稱ThsS/TtrS)，常表達(dá)啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位 點(diǎn)-ThsR/TtrR-終止子- ThsR/TtrR調(diào)節(jié)啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)(下稱ThsR/TtrR)。根據(jù)iGEM競(jìng)賽要求和后續(xù)Golden Gate拼裝，優(yōu)化DNA序列，刪除序列內(nèi)部RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)；為了后續(xù)質(zhì)粒構(gòu)建，在兩端分別加上Ⅰ酶切位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的黏性末端分別是：ThsS、TtrS上下游(5′–3′) ggag，agcg；ThsR、TtrR上下游(5′–3′) ggag，ctag。

1.2.2 ThsS/TtrS、ThsR-sfgfp/TtrR-sfgfp質(zhì)粒構(gòu)建

利用Golden Gate基因拼接方式構(gòu)建質(zhì)粒。首先通過(guò)PCR給每個(gè)片段加上Ⅰ酶切位點(diǎn)，表1方框中表示Ⅰ酶切位點(diǎn)，下劃線表示粘性末端。利用引物P1和P2擴(kuò)增pSB4K5，引物P3和P4擴(kuò)增pSB1C3，引物P5和P6擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：98 ℃變性5 min；98 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min 15 s (pSB4K5, pSB1C3)， 30 s ()，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將含有Ⅰ酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增片段pSB4K5和ThsS/TtrS質(zhì)粒(1∶1摩爾體積，總量不超過(guò)100 ng) 放入Golden Gate反應(yīng)體系中：1 μL T4 ligase，1 μLⅠ, 2 μL 10×T4裂解緩沖液，質(zhì)粒骨架和片段，補(bǔ)齊ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件如下：37 ℃ 5 min，16 ℃ 10 min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；然后37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，80 ℃ 5 min。用同樣的方法，將含有Ⅰ酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增片段pSB1C3、和ThsR/TtrR質(zhì)粒(1∶1∶1摩爾體積，總量不超過(guò)100 ng) 放入Golden Gate反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌.Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡那霉素(pSB4K5)/氯霉素(pSB1C3) 抗性LB固體平板，挑取3個(gè)單克隆，用小量質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，送往蘇州泓迅生物科技股份有限公司測(cè)序。

表1 引物序列

Ⅰrestriction sites in frame.

利用同樣的方法，我們將替換為粉色(, Part: BBa_K1033932)、藍(lán)色(, Part: BBa_K592009)和紫色(, Part: BBa_ K1033919) 色素蛋白編碼基因。

1.2.3 ThsR/TtrR-色素蛋白目的基因質(zhì)粒構(gòu)建

利用Gibson Assembly基因拼接方式構(gòu)建質(zhì)粒。選用帶有持續(xù)表達(dá)啟動(dòng)子和強(qiáng)RBS的pSEVA321質(zhì)粒骨架，將質(zhì)粒骨架與和編碼色素蛋白基因(基因展示規(guī)則為iGEM生物磚編號(hào)及該基因編碼的蛋白名稱)：

1. BBa_K1033910 “fwYellow yellow chromoprotein”

2. BBa_K1033916 “amajLime yellow-green chromoprotein”

3. BBa_K592010 “amilGFP yellow chromoprotein”

4. BBa_K1033919 “gfasPurple purple chromoprotein”

5. BBa_K1033932 “spisPink pink chromoprotein”

6. BBa_K592009 “amilCP blue chromoprotein”

7. BBa_K274003 “Vio operon ABDE”

8. BBa_I746916 “superfolder GFP”。

分別PCR帶上20 bp同源臂，將擴(kuò)增片段按照1∶1摩爾比，總量小于100 ng轉(zhuǎn)入Gibson Assembly體系中：Gibson Assembly 2×Mix 5 μL，骨架和/色素蛋白編碼基因片段，補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)條件如下：50 ℃ 60 min, 80 ℃ 5 min。轉(zhuǎn)化.Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布氯霉素抗性LB固體平板，挑取3個(gè)單克隆，用小量質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，送蘇州泓迅生物科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.4 流式細(xì)胞儀表征

將構(gòu)建成功的質(zhì)粒按照ThsS+ThsR、TtrS+TtrR的組合分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌.Top10和大腸桿菌.Nissle 1917感受態(tài)中，平板培養(yǎng)24 h。分別挑取3個(gè)單克隆加入含有25 μg/mL氯霉素、50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，然后稀釋過(guò)夜的菌液200倍，使用200 μL 96孔板蓋上呼吸膜在微孔振蕩器中，含有抗生素的M9培養(yǎng)基37 ℃、1 000 r/min生長(zhǎng)3 h，然后再將該菌液稀釋700倍，使用200 μL 96孔板蓋上呼吸膜在微孔振蕩器中，含有抗生素以及不同濃度硫代硫酸鈉(0、0.01 mmol/L、 0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.3 mmol/L、0.7 mmol/L；針對(duì)含ThsS+ThsR的菌)、連四硫酸鈉(0、 0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、1 mmol/L；針對(duì)含TtrS+TtrR的菌) 的M9培養(yǎng)基37 ℃、1 000 r/min 生長(zhǎng)6 h。從中取15 μL菌液至185 μL 1×PBS溶液(含2 mg/mL卡那霉素) 中，做流式細(xì)胞儀測(cè)試)。本實(shí)驗(yàn)使用不含質(zhì)粒的大腸桿菌.作為陰性對(duì)照。流式細(xì)胞儀使用清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)測(cè)試中心BD LSRFortessa FITC通道觀測(cè)sfGFP熒光強(qiáng)度。

圖1 生物傳感器A (ThsSR) 和B (TtrSR) 的基因線路圖

1.2.5 模擬糞便顏色觀察

將構(gòu)建成功的pSEVA321-/色素蛋白 編碼基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌.Top10中，平板培養(yǎng)24 h。分別挑取1個(gè)單克隆加入含有 25 μg/mL氯霉素的 20 mL LB培養(yǎng)液中37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，在50 mL離心管中離心后加入1 g “模擬糞便”咖喱和500 μL水混勻，觀察混合顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)器的構(gòu)建

2.2 報(bào)告基因的改進(jìn)

考慮到實(shí)際應(yīng)用中需要觀察糞便的顏色來(lái)判斷腸道健康情況，而腸道的無(wú)氧環(huán)境不利于GFP蛋白成熟和發(fā)出熒光[11]。此外，觀察GFP的顏色需要用紫外線激發(fā)，實(shí)際應(yīng)用中需要額外的設(shè)備可能帶來(lái)不便。我們決定使用可以直接肉眼觀測(cè)顏色的色素蛋白基因來(lái)替換，作為腸道炎癥的報(bào)告基因。為了選出使糞便變色最顯著的色素蛋白，我們使用有著類似于糞便顏色的咖喱模擬糞便與色素蛋白混合，將表達(dá)色素蛋白的大腸桿菌(LB培養(yǎng)基20 mL，200 r/min、37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜)混入1 g模擬糞便和500 μL水并攪拌均勻后的結(jié)果如圖3所示。可以看到，粉色色素蛋白(spisPink, Part: BBa_K1033932[12])、藍(lán)色色素蛋白(amilBlue, Part: BBa_K592009[13])以及紫色色素蛋白(gfasPurple，Part: BBa_K1033919[14])，在肉眼看來(lái)能夠最明顯地改變模擬糞便的顏色。這3種蛋白被進(jìn)一步選用，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的報(bào)告基因。

取其中表達(dá)粉色色素蛋白的大腸桿菌稀釋涂板，計(jì)算得到圖3 A中的20 mL離心菌含有7.6×1010個(gè)菌落，加入模擬糞便2.5 g還能分辨出顏色。

圖2 以sfgfp為報(bào)告基因A ThsSR和B TtrSR分別在E. coli Top 10和E. coli Nissle 1917中，對(duì)硫代硫酸鹽A和連四硫酸鹽B濃度梯度的響應(yīng)曲線

2.3 新系統(tǒng)的構(gòu)建

測(cè)試過(guò)這些色素蛋白在模擬大便中的變色效果后，我們將變色最明顯的3種色素蛋白基因片段分別轉(zhuǎn)入到了ThsSR和TtrSR系統(tǒng)中。此外，我們還測(cè)試了另一種墨綠色的色素分子紫色桿菌素前體(Proviolaceinic acid，BBa_K274003[15]) 作為報(bào)告基因的可能性。該色素分子也呈現(xiàn)出非常明顯的顏色，并且可以經(jīng)由微生物進(jìn)一步加工后變?yōu)樽仙珬U菌素，對(duì)腸道炎癥有潛在的治療效果[16]。

圖3 色素蛋白與模擬糞便混合帶來(lái)顏色變化的定性結(jié)果

圖4 以不同的色素蛋白或其他有色化學(xué)物質(zhì)作為報(bào)告基因時(shí)，ThsSR和TtrSR系統(tǒng)對(duì)誘導(dǎo)化學(xué)物的響應(yīng)

圖4展現(xiàn)了上述色素蛋白與紫色桿菌素前體作為報(bào)告基因時(shí)，ThsSR和TtrSR系統(tǒng)對(duì)誘導(dǎo)化學(xué)物的響應(yīng)?？梢钥吹剑褂肨hsSR系統(tǒng)時(shí)，紫色色素蛋白 (圖4A) 和粉色色素蛋白 (圖4B) 隨著誘導(dǎo)物濃度的增加，有肉眼可以分辨的響應(yīng)程度。藍(lán)色色素蛋白 (圖4C) 以及紫色桿菌素前體 (圖4D) 則存在嚴(yán)重的泄露，使得結(jié)果難以被肉眼區(qū)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ThsSR系統(tǒng)與紫色和粉色色素蛋白搭配是可用的組合。

使用TtrSR系統(tǒng)時(shí)，紫色色素蛋白 (圖4E)、粉色色素蛋白 (圖4F)、藍(lán)色色素蛋白 (圖4G) 均未隨誘導(dǎo)物濃度增加而呈現(xiàn)出肉眼能分辨的表達(dá)量差異。不過(guò)使用紫色桿菌素前體 (圖4F)作為報(bào)告基因時(shí)，響應(yīng)程度的差異則清晰可見(jiàn)。結(jié)果表明，使用TtrSR系統(tǒng)時(shí)紫色桿菌素前體是更合適的報(bào)告物。

3 討論

根據(jù)Daeffler和Galley等的研究，過(guò)多的TtrR可能會(huì)導(dǎo)致TtrSR系統(tǒng)失效。Daeffler等針對(duì)TtrS和TtrR選取了一系列的啟動(dòng)子在大腸桿菌.Nissle 1917中進(jìn)行表征，其中部分弱啟動(dòng)子體現(xiàn)出比較好的效果，有17–40倍的響應(yīng)范圍，然而當(dāng)TtrS的啟動(dòng)子強(qiáng)度過(guò)大時(shí)，一部分組合生長(zhǎng)受到影響；當(dāng)TtrR的啟動(dòng)子強(qiáng)度過(guò)大時(shí)，雖然生長(zhǎng)沒(méi)有受到影響，但是響應(yīng)卻消失了。在本文的TtrSR系統(tǒng)中，雖然TtrR的啟動(dòng)子和Daeffler等的一致，但是質(zhì)粒使用了高拷貝復(fù)制子pMB1 (500–700拷貝) 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原文中的拷貝數(shù)p15A10–15拷貝)，因此也出現(xiàn)了過(guò)多TtrR。

而猜測(cè)導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因是，雙組分TtrSR系統(tǒng)中，TtrS不僅能夠磷酸化，也能夠去磷酸化TtrR[17]。過(guò)多的磷酸化TtrR可能會(huì)間接促進(jìn)自身的去磷酸化，從而無(wú)法激活其下游對(duì)應(yīng)啟動(dòng)子P。

腸道炎癥檢測(cè)器是用改造過(guò)的大腸桿菌檢測(cè)腸道中的特定小分子并進(jìn)行色素蛋白的表達(dá)，色素蛋白可在人體腸道中降解，對(duì)人體無(wú)害；且相比于熒光蛋白，色素蛋白不需要紫外線照射就可辨認(rèn)，適用于家庭環(huán)境下的應(yīng)用。使用紫色桿菌素前體作為報(bào)告基因會(huì)帶來(lái)更多潛在的好處，例如該分子經(jīng)過(guò)加工將形成紫色桿菌素并具有抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗氧化等功能[16]，是一種潛在的腸道炎癥治療藥物，這可能使生物檢測(cè)器同時(shí)具備一定的治療功能。

實(shí)驗(yàn)表明，ThsSR、TtrSR這兩種生物檢測(cè)器系統(tǒng)在益生大腸桿菌.Nissle 1917中亦可工作，這意味著將來(lái)可以考慮把含有這兩種生物檢測(cè)器的益生菌制成膠囊給人服用，從而發(fā)揮檢測(cè)和治療的效果。在此基礎(chǔ)上，利用基因工程改造過(guò)的生物檢測(cè)器可以與低功耗的無(wú)線電子設(shè)備結(jié)合，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人體內(nèi)的生物信號(hào)[18]。

上文提到，7.6×1010個(gè)表達(dá)粉紅色素蛋白 的大腸桿菌加入模擬糞便2.5 g還能分辨出顏色。如果假設(shè)一個(gè)成年人每天排便1 kg，經(jīng)計(jì)算，需要使用表達(dá)粉紅色素蛋白的大腸桿菌約3×1013個(gè)。

考慮到測(cè)試者在家庭環(huán)境中實(shí)際應(yīng)用生物檢測(cè)器診斷腸道炎癥的場(chǎng)景，接下來(lái)可能還有很多困難需要克服。例如，真實(shí)糞便的顏色可能與模擬糞便的顏色有區(qū)別，可能還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，以建立不同的比色標(biāo)準(zhǔn)。再如，不同飲食習(xí)慣下的糞便顏色亦會(huì)有所不同，很難保證在任何條件下色素蛋白和色素分子都清晰可見(jiàn)，因此可能需要建議使用者在服用生物檢測(cè)器膠囊前后的一段時(shí)間內(nèi)飲食盡量清淡，或者與生物檢測(cè)器配套提供某種標(biāo)準(zhǔn)化的餐食。

圖5 紫色桿菌素前體對(duì)培養(yǎng)基的變色效果(左圖)，及其對(duì)照組(spisPink, Part: BBa_K1033932[7])效果(右圖)

此外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)紫色桿菌素前體分子易溶于水，且產(chǎn)量較大，變色效果非常明顯(圖5)。因此推斷，使用紫色桿菌素前體作為報(bào)告基因時(shí)，糞便在廁所中靜置一小段時(shí)間后，廁 所中水的顏色可能會(huì)為測(cè)試者提供更有效的判斷依據(jù)。

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團(tuán)隊(duì)簡(jiǎn)介：

SHSBNU_China北京師范大學(xué)第二附屬中學(xué)國(guó)際部iGEM隊(duì)伍成立于2017年，全員共有10人，包括隊(duì)員6人、2名指導(dǎo)指導(dǎo)研究生和2位指導(dǎo)老師。雖然這是北師大二附中隊(duì)伍的第一次參賽，但在全員的努力下，北師大二附中隊(duì)伍以“炎癥性腸病生物檢測(cè)器的構(gòu)建與調(diào)試”項(xiàng)目取得了1項(xiàng)金牌和3個(gè)單項(xiàng)獎(jiǎng)提名的優(yōu)異成績(jī)。在即將到來(lái)的2018 iGEM中，北師大二附中隊(duì)伍將致力于用細(xì)菌生產(chǎn)漆酶從而降解對(duì)環(huán)境有危害的靛藍(lán)染料。

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction and characterization of a bio-detector for inflammatory bowel disease

Weihang Guo1*, Boxuan Li1*, Haoyu Zhou1*, Chen Zhang1, Xuan Wang2, and Chuan Ni1

1 Second High School Attached to Beijing Normal University, Beijing 100192, China 2School of Life Sciences, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Genetically engineered intestinal microbes could be powerful tools to detect and treat intestine inflammation due to their non-invasive character, low costs, and convenience. Intestinal inflammation is usually detected along with an increasing concentration of thiosulfate and tetrathionate molecules in the intestines. ThsSR and TtrSR are two-component biosensors to detect the presence of thiosulfate and tetrathionate molecules, respectively. In real-life intestinal inflammation detection, sophisticated instruments are needed if using fluorescent proteins as reporters. However, chromoproteins and other colored small molecules, which can be seen by the unaided eye, could extend the use of ThsSR and TtrSR biosensors to detect intestine inflammation. The feasibility of ThsSR and TtrSR systems was tested by monitoring the fluorescence intensity of sfGFP in response to the concentration of thiosulfate and tetrathionate, followed by the incorporation of the two systems intoTop10 and.Nissle 1917. The potential for the real-life application of the two systems was further corroborated by substituting sfGFP with a series of chromoproteins and a protoviolaceinic acid synthesis cassette as reporter genes. The results indicated that signal expression of the new systems had a positive correlation with the concentration of tetrathionate and thiosulfate molecules. Thus, the modified ThsSR and TtrSR system may potentially be applied in the human body for the detection of intestinal inflammation.

inflammatory bowel disease, thiosulfate, tetrathionate, bio-detector, chromoprotein, protoviolaceinic acid

July 1, 2018;

September 29, 2018

Xuan Wang. Tel: +86-10-62772676; E-mail: xuan-wan16@mails.tsinghua.edu.cn

Chuan Ni. Tel: +86-10-82738787-3186; Fax: +86-10-82738787-3199; E-mail: nichuan@shsbnu.cn

10.13345/j.cjb.180271

*These authors contributed equally to this study.