哺乳動物抑制型轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對的全新設(shè)計與構(gòu)建

楊子杰，潘祎杰，蔡毅鳴，傅彤，馮驁，劉燕，王一恒，熊心旋，蔡亮

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哺乳動物抑制型轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對的全新設(shè)計與構(gòu)建

楊子杰，潘祎杰，蔡毅鳴，傅彤，馮驁，劉燕，王一恒，熊心旋，蔡亮

復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438

楊子杰, 潘祎杰, 蔡毅鳴, 等. 哺乳動物抑制型轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對的全新設(shè)計與構(gòu)建.生物工程學(xué)報, 2018, 34(12): 1886–1894.Yang ZJ, Pan YJ, Cai YM, et al. De novo construction of mammalian synthetic inhibitory transcription factor and promoter pairs. Chin J Biotech, 2018, 34(12): 1886–1894.

轉(zhuǎn)錄因子及啟動子是基因回路的基礎(chǔ)。相較于原核啟動子，真核啟動子作用機制復(fù)雜，增加了全新設(shè)計與改造的難度。目前有限數(shù)量的真核轉(zhuǎn)錄因子及啟動子成為在哺乳動物細(xì)胞中設(shè)計并實現(xiàn)復(fù)雜基因回路以滿足各類臨床或工業(yè)應(yīng)用需求的瓶頸。文中介紹了基于能夠結(jié)合特定DNA序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過柔性連接肽連接到轉(zhuǎn)錄抑制模塊KRAB，構(gòu)建抑制型轉(zhuǎn)錄因子以及通過在SV40啟動子下游插入結(jié)合序列構(gòu)建對應(yīng)啟動子的方法。而后，在哺乳動物細(xì)胞系中通過流式細(xì)胞術(shù)對其抑制轉(zhuǎn)錄的強度、不同轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對之間的正交性進行了測定。文中提供了一套標(biāo)準(zhǔn)化的、可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子及啟動子的全新設(shè)計與構(gòu)建方案。基于該方案所構(gòu)建的5對抑制型轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對能夠在哺乳動物細(xì)胞中起到不同程度的抑制效果且相互正交。文中構(gòu)建的哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對擴充了哺乳動物生物元件庫，為構(gòu)建復(fù)雜真核基因回路打下了基礎(chǔ)；運用該設(shè)計方法能夠根據(jù)需求構(gòu)建更多正交的人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對。

真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控，人工轉(zhuǎn)錄因子，人工啟動子，合成生物學(xué)，生物元件

真核轉(zhuǎn)錄因子及啟動子是真核生物基因表達調(diào)控的基礎(chǔ)元件之一；在各層次的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控十分重要[1]。大部分真核啟動子受結(jié)合其特定DNA序列的蛋白質(zhì)調(diào)控[2]。啟動子作為轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)信息節(jié)點，不僅對基因的表達起到了開關(guān)的作用，同時也影響著轉(zhuǎn)錄的動力學(xué)[3]。

真核轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對基因表達的調(diào)控主要分為兩種方式：1) 轉(zhuǎn)錄因子招募RNA聚合酶并起始轉(zhuǎn)錄[4]的激活型轉(zhuǎn)錄調(diào)控；2) 阻礙RNA聚合酶與DNA結(jié)合以阻礙轉(zhuǎn)錄發(fā)生[5]的抑制型調(diào)控。相較于激活型轉(zhuǎn)錄調(diào)控，抑制型轉(zhuǎn)錄調(diào)控在實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的基因回路中具有更加重要意義。近些年，合成生物學(xué)研究的進展，實現(xiàn)了利用抑制型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件構(gòu)建負(fù)反饋信號通路從而加速信號達到穩(wěn)態(tài)的時間[6]、雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)[7]、振蕩器[8]、基于三節(jié)點非協(xié)調(diào)前饋環(huán)的帶通信息傳遞[9]、布爾邏輯運算[10]等，然而上述的進展多集中在原核細(xì)胞中，真核細(xì)胞尤其是在哺乳動物細(xì)胞中能夠被使用的抑制型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件十分有限。

在構(gòu)建人工基因回路時，需要考慮宿主的內(nèi)源信號對構(gòu)建的基因回路的干擾；通過使用跨物種啟動子或者使用人工合成的啟動子，使得設(shè)計的基因回路信號與宿主基因回路信號正交，是維持系統(tǒng)魯棒性的關(guān)鍵[11]。在設(shè)計轉(zhuǎn)錄因子及啟動子時，需要關(guān)注不同轉(zhuǎn)錄因子及啟動子間的正交性，以確保網(wǎng)絡(luò)間的節(jié)點不會相互干擾。

通過結(jié)合特異DNA序列的蛋白，比如鋅指蛋白 (Zinc finger，ZF)[12]，或者轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物 (Transcription activator-like effector，TALE)[13]以及規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)[14]技術(shù)都能夠構(gòu)建特異識別某個DNA位點并實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活或者抑制的元件，即實現(xiàn)人工設(shè)計的轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對。因為轉(zhuǎn)入到哺乳動物細(xì)胞中的外源基因大小是有限的，小尺寸的ZF有望在有限長度的回路中實現(xiàn)更復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，成為本研究的首選。本研究中使用的三重復(fù)的ZF在理論上最多能夠識別49個不同序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DNA binding domain，DBD)，提供了極大的可能性來滿足系統(tǒng)的正交性。

本研究基于人工合成的ZF并融合了轉(zhuǎn)錄抑制模塊KRAB，配合在SV40啟動子后插入能夠被人工合成的ZF所特異性結(jié)合的DNA序列，構(gòu)建了能夠在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用的抑制型人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對。文中總結(jié)了人工轉(zhuǎn)錄因子啟動子對的設(shè)計范式，并檢驗了其在哺乳動物細(xì)胞系中應(yīng)用的抑制能力以及正交性。這樣的人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對的構(gòu)建為實現(xiàn)復(fù)雜的真核轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)提供了嶄新的機遇。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞系與載體

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自天根生物公司；HeLa及293T細(xì)胞由實驗室保存；pSB1C3載體取自2017 iGEM distribution kit (plate 4 4B，BBa_J04450)；pML2-EGFP-P2A和pML2-mCherry-N1 載體由實驗室保存。

1.2 試劑及耗材

DNA限制性內(nèi)切酶RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、d Ⅲ、Ⅰ和T4 DNA連接酶、DNA marker購自NEB公司；Phanta高保真PCR酶購自Vazyme公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Thermo公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自Axygen公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；NaCl購自BBI公司；蛋白胨和酵母膏購自O(shè)XOID公司。

1.3 抑制型啟動子 (SynPro) 構(gòu)建

人工合成抑制型啟動子 (SynPro) 由SV40啟動子與不同重復(fù)數(shù)量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點 (REs) 組成，其序列如表1所示。在啟動子及REs前端加上前綴序列 (GAATTCGCGGCCGCTTCT AG)，包含保護堿基以及RⅠ、Ⅰ 酶切位點；在后端加上后綴序列 (TACTAGTAGCGGCC GCTGCAG)，包含保護堿基以及Ⅰ、Ⅰ酶切位點。將REs 分成兩份：一份使用RⅠ、Ⅰ內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h并膠回收得到前置片段；一份使用Ⅰ、Ⅰ內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h并膠回收得到后置片段；將pSC1C3載體利用RⅠ、Ⅰ內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h并膠回收得到線性化載體；將前置片段與后置片段以及線性化pSC1C3載體利用T4 DNA連接酶在16 ℃連接10 h以上。

由于Ⅰ與Ⅰ是同尾酶，所以能夠?qū)⑶爸眯蛄信c后置序列連接在載體上形成兩次重復(fù)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點 (2×Es)，并且2×REs的前后綴都被保留。利用前綴引物與后綴引物進行PCR得到2×REs序列，重復(fù)上述過程并替換前后置序列得到N次重復(fù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列 (N×REs)。將前置序列替換為SV40啟動子，后置序列為N×REs，能夠得到抑制型啟動子pSV40-N×REs。在本研究中，利用上述方法構(gòu)建了2×RES、4×REs、8×REs片段。

其中，SV40啟動子由PCR擴增自pQM6.2質(zhì)粒 (本實驗室保存)，4×UAS 由PCR擴增自LR041質(zhì)粒 (iGEM 2017 Tsinghua-A隊伍提供)，其余REs片段由IDT公司以gBlock形式合成。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并涂布于含氯霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)14 h。重組克隆都通過Sanger測序驗證正確。

1.4 人工合成抑制型轉(zhuǎn)錄因子 (Syn-TFs) 構(gòu)建

在KRAB序列前添加核定位信號 (PKKKRKV)與柔性連接肽G4S (GGGGS)，構(gòu)成 (G4S)-NLS- KRAB片段。轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DNA binding domain，DBD) 的DNA序列如表1所示，通過PCR將DBD與 (G4S)-NLS-KRAB片段融合，構(gòu)成抑制型轉(zhuǎn)錄因子編碼序列DBD-(G4S)-NLS- KRAB。其中，KRAB (RTLVT FKDVF VDFTR EEWKL LDTAQ QIVYR NVMLE NYKNL VSLGY QLTKP DVILR LEKGE EPWLV) 片段由PCR擴增自LR041 (iGEM 2017 Tsinghua-A隊伍提供)，DBD片段由IDT公司以gBlock形式合成。

表1 DBD序列以及對應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點 (RE) 序列

1.5 表達載體構(gòu)建

通過PCR在抑制型啟動子pSV40-N×REs 5′端加上Ⅰ酶切位點以及保護堿基；利用RⅠ、Ⅰ內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h并膠回收合成啟動子片段；用RⅠ、Ⅰ內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h并膠回收得到pML2-mCherry-N1線性化的載體；用T4 DNA連接酶在16 ℃連接10 h以上，得到由抑制型啟動子驅(qū)動mCherry表達的pML2-pSV40-N×REs真核表達載體 (質(zhì)粒B；圖2A)。

通過PCR在抑制型轉(zhuǎn)錄因子DBD-(G4S)-NLS- KRAB 3′端加上Ⅰ酶切位點及保護堿基，在5′端加上d Ⅲ酶切位點以及保護堿基；用Ⅰ、d Ⅲ內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h并膠回收合成轉(zhuǎn)錄因子片段；用Ⅰ、d Ⅲ內(nèi)切酶37 ℃酶切1 h并膠回收得線性化載體pML2-EGFP-P2A；用T4 DNA連接酶在16 ℃連接10 h以上，得到EGFP-P2A與DBD-(G4S)-NLS-KRAB編碼序列融合的真核表達載體pML2-EGFP-P2A- DBD-(G4S)-NLS-KRAB (質(zhì)粒A；圖2A)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞都是在含有10% FBS的DMEM (Gibco) 中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中還添加有終濃度為每毫升100單位青霉素、100 μg鏈霉素和2 mmol/L谷氨酸。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.7 流式細(xì)胞分析

HeLa細(xì)胞或293T細(xì)胞在密度達70%左右的時候?qū)ζ溥M行pML2-pSV40-N×REs與pML2-EGFP- P2A-DBD-(G4S)-NLS-KRAB質(zhì)粒的兩兩配對共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染24 h后報告基因mCherry的表達量由流式細(xì)胞儀 (FASCJazz，BD) 對紅色熒光強度測量 (每種實驗條件至少記錄20 000個雙色細(xì)胞的熒光強度)。流式數(shù)據(jù)使用FlowJo 10軟件進行分析。以共轉(zhuǎn)染了CMV-EGFP和pSV40-mCherry的細(xì)胞群體的EGFP 平均熒光強度 (MFI，Mean fluorescence intensity) 作為內(nèi)參，按照如下公式對各組的mCherry MFI進行校正處理：

2 結(jié)果與分析

2.1 SynTF-SynPro對的設(shè)計

本研究提出了一種定制哺乳動物人工轉(zhuǎn)錄因子 (Synthetic transcription factor，SynTF) 及人工啟動子 (Synthetic promoter，SynPro) 的方法。SynTF具有標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)構(gòu)，從其N端到C端，3個核心結(jié)構(gòu)域依次是：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (DNA binding domain，DBD)、核定位序列 (Nuclear location sequence，NLS) 和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。DBD能夠識別并結(jié)合特定DNA序列，即響應(yīng)元件 (Response element，RE)。為了增加核心元件間的靈活性，G4S柔性接頭序列 (Linker)[15]被插入到DBD和SV40 NLS[16]之間。通過選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的類型，能夠設(shè)計抑制型或激活型的SynTF (Silencing-form SynTF，SynTF(S)；Activating-form SynTF，SynTF(A)；圖1A)。通過使用KRAB[5]作為抑制型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，能夠構(gòu)建抑制型SynTF。與抑制型SynTF配對的是抑制型人工啟動子SynPro (Silencing-form SynPro，縮寫為SynPro(S)；圖1A)。相對于將RE插入到組成型啟動子上游[17]，將重復(fù)數(shù)量的RE插入到啟動子pSV40的下游構(gòu)建所得的SynPro(S) 具有如下功能：1) KRAB招募轉(zhuǎn)錄抑制物能夠抑制啟動子表達[18]；2) 由于RE位于組成型啟動子下游，當(dāng)SynTF(S) 結(jié)合到RE上時，能夠?qū)е驴臻g位阻，通過抑制RNA聚合酶的正向運動而增強轉(zhuǎn)錄抑制的能力。該設(shè)計使得SynPro(S) 在對應(yīng)的SynTF(S) 不存在的情況下表達；而在SynTF(S) 存在的情況下，啟動子下游的基因表達被抑制 (圖1A)。

圖1 SynTF-SynPro的設(shè)計

設(shè)計高性能人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子即SynTF-SynPro對的關(guān)鍵步驟是尋找特異性高、結(jié)合力強的DBD。為了擴充可以供哺乳動物細(xì)胞使用的DBD，將在其他物種中研究較為透徹的轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)化后應(yīng)用到哺乳動物細(xì)胞中是很好的策略。通過這種方法選擇出了3個不同來源的DBD序列Gal4[19]、PIP[20]、ZFHD1[21]用于構(gòu)建SynTF。此外，已被良好表征的DBD數(shù)量不能滿足構(gòu)建多種SynTF-SynPro對的需求，故而利用能夠?qū)?個相鄰堿基進行特異性識別的鋅指蛋白 (Zinc finger，ZF) 的順序連接來實現(xiàn)對多種特異的多位DNA位點進行識別[12]，構(gòu)建可在哺乳動物細(xì)胞應(yīng)用的合成ZF (Synthetic ZF)。通過將三串聯(lián)Cys2-His2ZF[22]作為鋅指蛋白底盤，替換ZF[22]上和DNA相互作用有關(guān)的氨基殘基[23]，構(gòu)建了多種ZF以便進一步的測試 (圖1B)。

2.2 SynTF-SynPro的分子克隆和抑制能力測試

表2列出了所有完成的SynTF-SynPro對。為方便描述，以pSV40-N×RE的形式命名SynPro(S)，其中，N指插入RE的重復(fù)數(shù)，RE的名稱用DBD-KRAB的名稱替代。

表2 完成的SynTF-SynPro對

通過雙質(zhì)粒雙熒光測試系統(tǒng) (圖2A) 能夠檢測SynTF-SynPro對是否工作。其中，質(zhì)粒A搭載有強啟動子CMV所轉(zhuǎn)錄的EGFP和SynTF，使得SynTF表達充分。P2A將EGFP與SynTF相連，使得SynTF的表達量和EGFP相同[24]。由此，通過測量EGFP的表達量能夠表征SynTF的表達量。質(zhì)粒B搭載由SynPro所轉(zhuǎn)錄的mCherry，通過測量mCherry的表達量能夠表征SynPro在不同條件下的表達強度。EGFP和mCherry的熒光強度由流式細(xì)胞儀測量；在設(shè)備參數(shù)一致的情況下，可以通過比較樣品間的熒光強度衡量彼此間表達量的差異。

在構(gòu)建的7個SynTF(S)-SynPro(S) 對中，有6對通過了雙質(zhì)粒雙熒光的抑制能力測試 (圖2B)。能夠工作的SynPro(S)在共轉(zhuǎn)染對應(yīng)SynTF(S)的情況下 (圖2B的淺色柱狀圖)，相較于未轉(zhuǎn)染對應(yīng)的SynTF(S) 的情況下 (圖2B的深色柱狀圖) mCherry的表達水平顯著降低。說明SynTF(S) 的存在降低了SynProS(S) 所轉(zhuǎn)錄的mCherry的表達量，即抑制了對應(yīng)的SynPro(S) 的轉(zhuǎn)錄。未被抑制的SynPro(S) 的表達強度較被抑制的組相比要高15–106倍不等 (5×UAS：106倍；4×PIP：15倍；4×ZFHD1：22倍；8×ZF21-16：57倍；8×ZF42-10：98倍；8×ZF43-8：44倍)。除了ZF42-10，其余SynPro(S) 基礎(chǔ)表達水平相對于pSV40都有所降低。

2.3 SynTF-SynPro對正交性測試

在同時使用多個SynTF-SynPro對設(shè)計復(fù)雜回路時，為了能夠在轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)回路間的互不干擾，SynTF-SynPro對需要互相正交。使用交叉配對的雙質(zhì)粒雙熒光測試，即分別向HeLa細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染配對與非配對的SynTF(S) 與SynPro(S)，使用流式細(xì)胞儀器測量mCherry的熒光強度并計算出抑制效果，對5對能正常工作的SynTF-SynPro對進行了正交性測試。在正交性熱圖中，每一個格子的顏色深淺和數(shù)值代表了在共同轉(zhuǎn)染了SynTF后的歸一化SynPro表達水平。其中，左上到右下對角線上的網(wǎng)格最暗，代表了只有在共轉(zhuǎn)染配對SynTF時，SynPro的表達水平最低，即非配對SynTF的抑制效果總是比配對SynTF的抑制效果差：因此，這5個SynTF-SynPro對都是互相正交的 (圖3)。其中常用的3種DBD (Gal4、PIP、ZFHD1) 正交表現(xiàn)良好。與依賴于ZF構(gòu)建的SynTF(S)-SynPro(S) 對相比，搭載了天然DBD對應(yīng)RE的SynPro(S) 的表達水平相對較低。值得注意的是，右下角的灰色框內(nèi)的pSV40-8×ZF21-16和pSV40-8×ZF43-8在配對的SynTF存在的情況下，表達被充分抑制，但在加入非對應(yīng)的SynTF時，仍維持較高的基本表達。圖底兩行右側(cè)的格子說明基于合成ZF設(shè)計的幾種SynPro(S) 在非配對的SynTF存在的情況下有較高的表達水平，但是在存在配對的ZF時維持著較低的表達水平。綜上，基于ZF設(shè)計的SynPro(S) 幾乎不會與非對應(yīng)DBD相互作用，具有較好的特異性和較大的抑制倍率。

圖2 雙質(zhì)粒雙熒光測試系統(tǒng)示意圖以及測試結(jié)果

ZF42-10在沒有共轉(zhuǎn)染對應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的時候，其表達水平就顯著高于pSV40啟動子的基礎(chǔ)表達水平，無法使用 (圖2B)。ZF42-10基礎(chǔ)表達水平高，有可能是因為細(xì)胞內(nèi)源蛋白能夠和ZF42-10相互作用，起到轉(zhuǎn)錄激活的效果。

3 結(jié)論與討論

基于天然轉(zhuǎn)錄因子的DBD或人工ZF以及其對應(yīng)的RE，文中提供了一套標(biāo)準(zhǔn)化的人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子的設(shè)計方案。利用這一套方案，成功構(gòu)建了若干抑制型的人工合成的轉(zhuǎn)錄因子及啟動子。通過雙質(zhì)粒雙熒光測試，共有5對SynTF-SynPro對 (Gal4、PIP、ZFHD1、ZF21-16、ZF43-8) 具有較好的抑制效果并且相互正交。本研究完成的轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對擴充了哺乳動物細(xì)胞能夠利用的合成生物學(xué)元件庫。同時，這些SynTF-SynPro對具有不同的抑制強度，可利用類似的方法設(shè)計更多性質(zhì)不同的SynTD-SynPro對，用于設(shè)計復(fù)雜的哺乳動物基因回路。

圖3 SynTF-SynPro對的正交性測試結(jié)果

在此基礎(chǔ)上，利用激活型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，例如VP64[4]，能夠構(gòu)建正交的激活型SynTF-SynPro對 (圖1A)；相較于在酵母中利用鋅指蛋白構(gòu)建可定制的激活型轉(zhuǎn)錄因子及啟動子[23]，本研究拓寬了構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子時DBD的選擇范圍，并將抑制型人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子應(yīng)用到了哺乳動物細(xì)胞中并驗證了其可用性，擴大了人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子的應(yīng)用范圍。

本研究的工作僅局限在對轉(zhuǎn)錄因子的抑制穩(wěn)態(tài)進行測試，缺乏轉(zhuǎn)錄動力學(xué)性質(zhì)的測試，有待后續(xù)實驗進一步完善。此外，RE的重復(fù)數(shù)量、RE到啟動子的距離對轉(zhuǎn)錄強度的影響是兩個值得關(guān)注的問題，能否通過調(diào)節(jié)重復(fù)數(shù)量或者啟動子與編碼框的距離，實現(xiàn)對抑制型轉(zhuǎn)錄因子的抑制效果的調(diào)整，也是值得跟進的研究。

隨著ZF的高通量開發(fā)技術(shù)OPEN[25-26]和CoDA[27]的實現(xiàn)以及鋅指蛋白數(shù)據(jù)庫 (Zinc finger database)[28]的建立，今后人們能夠更好地利用ZF高度模塊化的特性，通過選擇不同的DBD和RE組合，構(gòu)建出數(shù)量龐大且性能優(yōu)異的哺乳動物人工轉(zhuǎn)錄因子及啟動子對，從而在哺乳動物細(xì)胞中利用合成生物學(xué)手段實現(xiàn)復(fù)雜的功能，如哺乳動物邏輯門的構(gòu)建、細(xì)胞水平的計算等。現(xiàn)階段的原核生物邏輯門的構(gòu)建利用了啟動子組合構(gòu)建二元布爾邏輯門[10]；在真核生物中，利用特定啟動子配合轉(zhuǎn)錄后調(diào)控也能實現(xiàn)多種邏輯運算[29]。利用SynTF-SynPro對的轉(zhuǎn)錄活性的正交性，本研究中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化、可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子及啟動子設(shè)計方案，有望為將來復(fù)雜回路的構(gòu)建打下基礎(chǔ)，實現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)完全的邏輯計算。

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團隊簡介：

iGEM 2017 Fudan團隊是于2017年代表復(fù)旦大學(xué)參加iGEM大賽的代表隊之一。團隊內(nèi)學(xué)生共計8人，包括隊長楊子杰和7名隊員 (潘祎杰、蔡毅鳴、傅彤、馮驁、劉燕、王一恒、熊心旋)；主要為2015級復(fù)旦大學(xué)本科生。團隊指導(dǎo)老師蔡亮和盧大儒，來自生命科學(xué)學(xué)院。團隊于2017年初成立。在2017年iGEM大賽準(zhǔn)備中，團隊成員積極合作，相互促進，共同進步，最終奪得2017年最佳治療項目。賽后，團隊成員繼續(xù)致力于iGEM理念的推廣，在校內(nèi)外多項活動中表現(xiàn)突出。

(本文責(zé)編 郝麗芳)

construction of mammalian synthetic inhibitory transcription factor and promoter pairs

Zijie Yang, Yijie Pan, Yiming Cai, Tong Fu, Ao Feng, Yan Liu, Yiheng Wang, Xinxuan Xiong, and Liang Cai

School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China

Transcriptional regulation is crucial for regulated gene expression. Due to the complexity, it has been difficult to engineer eukaryotic transcription factor (TF) and promoter pairs. The few availabilities of eukaryotic TF and promotor pairs limit their practical use for clinical or industrial applications. Here, we report aconstruction of synthetic inhibitory transcription factor and promoter pairs for mammalian transcriptional regulation. The design of synthetic TF was based on the fusion of DNA binding domain and Kruppel associated box transcription regulating domain (KRAB). The synthetic promoter was constructed by inserting the corresponding TF response element after SV40 promoter. We constructed and tested five synthetic inhibitory transcription factor and promoter pairs in cultured mammalian cells. The inhibition capability and orthogonality were verified by flow cytometry. In summary, we demonstrate the feasibility of constructing mammalian inhibitory TF and promoter pairs, which could be standardized for advanced gene-circuit design and various applications in the mammalian synthetic biology.

eukaryotic transcription regulation, synthetic transcription factor, synthetic promoter, synthetic biology, Bio-Brick

July 11, 2018;

September 13, 2018

National Top Talent Undergraduate Training Program of Ministry of Education of China (Nos. 20180202, 20160804), Fudan?s Undergraduate Research Opportunities Program.

Liang Cai. Tel: +86-21-31246727; E-mail: cail@fudan.edu.cn

*These authors contributed equally to the study.

教育部“基礎(chǔ)學(xué)科拔尖學(xué)生培養(yǎng)計劃”研究課題經(jīng)費(Nos. 20180202，20160804)，復(fù)旦大學(xué)本科生學(xué)術(shù)研究資助計劃(FDUROP) 資助。

2018-10-18

10.13345/j.cjb.180290

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181016.1353.001.html