攜帶線粒體ND1基因3497C＞T突變的Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系臨床與遺傳學(xué)分析

梁敏，侯玲玲，姜豐，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種線粒體遺傳性視神經(jīng)疾病，主要發(fā)病人群為青年男性，發(fā)病年齡常在17～30歲[1-2]。眼科檢查主要表現(xiàn)為雙眼視力同時(shí)或先后下降，可有視野缺失或色覺(jué)障礙[3-5]。線粒體DNA（mtDNA）3個(gè)原發(fā)突變是LHON發(fā)病的分子基礎(chǔ)[6-9]，線粒體新突變位點(diǎn)和繼發(fā)突變位點(diǎn)在LHON的發(fā)病過(guò)程中起重要作用[10-13]。本研究主要對(duì)6個(gè)攜帶線粒體基因3497C＞T（m.3497C＞T）突變的LHON家系進(jìn)行家系調(diào)查，對(duì)6例先證者進(jìn)行了詳細(xì)眼科學(xué)檢查及線粒體基因組測(cè)序，并分析了m.3497C＞T突變對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶活性的影響。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 對(duì)6個(gè)攜帶m.3497C＞T突變的LHON家系進(jìn)行家系調(diào)查，對(duì)家系先證者進(jìn)行發(fā)病情況詢問(wèn)，并進(jìn)行詳細(xì)的眼科檢查。選取無(wú)血緣關(guān)系的2名正常人作為正常對(duì)照，抽取先證者和正常對(duì)照者EDTA-K抗凝靜脈血10 mL，其中5 mL用于建立轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞系，其他用于提取全基因組DNA，-80 ℃保存。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與本研究的患者家系及正常對(duì)照人群均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 眼科學(xué)檢查：對(duì)6個(gè)家系先證者進(jìn)行臨床眼科檢查，包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)視力表檢測(cè)視力，眼底鏡，Canon CR6-45NM眼底照相機(jī)，光學(xué)相干斷層掃描儀（OCT檢查儀，德國(guó)Heidelberg公司）。雙眼視力損傷參照WHO（http://www.who.int/en/）標(biāo)準(zhǔn)：正?！?.3；0.1≤輕度損傷＜0.3；0.05≤中度損傷＜0.1；0.02≤重度損傷＜0.05；極重度損傷＜0.02。

1.2.2 線粒體基因組檢測(cè)與分析：將6例家系先證者和2例正常對(duì)照者經(jīng)EDTA-K2抗凝的全血用經(jīng)典的酚/氯仿法提取全基因組DNA，NanoDrop1000測(cè)定濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使?4對(duì)有部分重疊的正反向引物（引物可完全覆蓋整個(gè)線粒體基因組序列）對(duì)6例家系先證者及對(duì)照者線粒體全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用AxyPrep PCR Clean-up Kit純化后送杭州擎科生物科技有限公司測(cè)序。通過(guò)統(tǒng)計(jì)突變位點(diǎn)在正常對(duì)照者中的發(fā)生頻率、線粒體多肽、rRNA或tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)定位及種系發(fā)育分析等分析mtDNA其他突變位點(diǎn)致病性并確定其線粒體單體型。

1.2.3 轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞系的構(gòu)建及呼吸鏈復(fù)合物酶活力的分析：對(duì)6例先證者和2例正常對(duì)照者通過(guò)EB病毒轉(zhuǎn)化建立人類永生化外周血淋巴母細(xì)胞系，按照King和Attardi方法建立轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞系[14]，在含有單個(gè)克隆的培養(yǎng)皿內(nèi)分離出狀態(tài)穩(wěn)定的細(xì)胞。按照常規(guī)酚-氯仿方法分別提取轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞的DNA，檢查其基因型，以證實(shí)所得到轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞的線粒體來(lái)自相應(yīng)的淋巴細(xì)胞。大量提取細(xì)胞線粒體，并進(jìn)行線粒體蛋白濃度測(cè)定，進(jìn)行線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性的測(cè)定，評(píng)估m(xù).3497C＞T突變對(duì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶活力的影響。

2 結(jié)果

2.1 攜帶m.3497C＞T突變LHON家系的家系調(diào)查 6個(gè)LHON家系共158名成員，其中母系成員100名。每個(gè)家系都只有1名成員發(fā)病，6例患者中男性患者5例，女性患者1例，外顯率分別為5%，6.25%，6.25%，4.76%，5.88%，10%。除LHON表現(xiàn)外，臨床檢查均未發(fā)現(xiàn)其他臨床病癥。見(jiàn)圖1。

圖1 6個(gè)攜帶m.3497C＞T突變位點(diǎn)家系的家系圖（黑色代表患者，箭頭代表先證者）

2.2 攜帶m.3497C＞T突變的先證者臨床資料分析及眼科學(xué)檢查 6例先證者中包含1例女性和5例男性，最小發(fā)病年齡7歲，最大37歲。2例重度視力損失，1例中度視力損失，3例輕度視力損失，見(jiàn)表1。眼底檢查先用直接檢眼鏡檢查，然后用眼底照相機(jī)拍照，如圖2所示，患者主要表現(xiàn)為視盤(pán)色淡，邊界不清，周?chē)⊙苡厍?例重度視力損傷患者中，LP002-IV-2患者表現(xiàn)為視盤(pán)顳側(cè)色淡，小血管迂曲擴(kuò)張，LP004-III-11患者雙眼視盤(pán)顳側(cè)色淡，邊界不清。利用OCT對(duì)6例先證者視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層（retinal nerve fiber layer，RNFL）厚度測(cè)量發(fā)現(xiàn)，LP002-IV-2患者RNFL在左眼的鼻側(cè)和顳側(cè)象限、右眼顳側(cè)象限明顯變薄，LP004-III-11患者雙眼顳側(cè)象限RNFL厚度明顯變薄，其余4例患者RNFL厚度無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3。

2.3 攜帶m.3497C＞T突變的先證者線粒體全基因組分析 對(duì)6例攜帶m.3497C＞T突變的先證者行線粒體全序列分析，如表2所示，共發(fā)現(xiàn)74個(gè)變異位點(diǎn)，進(jìn)一步分析顯示這些突變均為同質(zhì)性突變，包括67個(gè)已報(bào)道的和7個(gè)未報(bào)道的位點(diǎn)[15]。其中錯(cuò)義突變12個(gè)（10個(gè)已報(bào)道，2個(gè)新突變），并未發(fā)現(xiàn)與LHON相關(guān)的ND4基因11778G＞A，ND6基因14484T＞C，ND1基因3460G＞A三個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)。這些先證者線粒體單體型分別屬于B4c1b、B4c1b、N9a4、B4c1、B4c1b和B4c1b2。

表1 攜帶線粒體ND1基因3497C＞T突變的6例先證者臨床資料

圖2 6例先證者眼底表現(xiàn)

2.4 攜帶m.3497C＞T突變的細(xì)胞株酶活力分析為了確定m.3497C＞T突變對(duì)線粒體氧化呼吸鏈各復(fù)合體活性的影響，測(cè)定攜帶m.3497C＞T突變的先證者和同屬B單體型的正常對(duì)照樣本（正常對(duì)照-1和正常對(duì)照-2）各復(fù)合體的酶活性。通過(guò)將復(fù)合體I、復(fù)合體II、復(fù)合體III和復(fù)合體IV的酶促反應(yīng)速率以檸檬酸合酶的酶促反應(yīng)速率為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算不同復(fù)合體樣本間的相對(duì)酶活性[16]。研究顯示，攜帶突變的患者復(fù)合體I的活性平均降低12.4%。各個(gè)細(xì)胞株復(fù)合體II、復(fù)合體III和復(fù)合體IV活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖4）。

圖3 6例先證者OCT檢查結(jié)果

表2 攜帶線粒體ND1基因3497C＞T突變的6例先證者線粒體全序列分析

續(xù)表2

3 討論

LHON最常累及青壯年男性，視力下降往往是突發(fā)性且永久性的，也難以矯正，這給患者帶來(lái)了極大的痛苦。mtDNA 3個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)是LHON發(fā)病的分子基礎(chǔ)，線粒體繼發(fā)突變位點(diǎn)在LHON的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[10-13]。

圖4 線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體酶活性的檢測(cè)

本研究主要對(duì)6例攜帶m.3497C＞T突變位點(diǎn)的LHON家系進(jìn)行調(diào)查，對(duì)6例先證者進(jìn)行了詳細(xì)的眼科學(xué)、分子和生化功能分析，這6例患者的發(fā)病年齡平均是20歲，這與其他攜帶m.11778G＞A突變的LHON家系一致[17]，然而這6個(gè)家系中，都只有一個(gè)成員患病，發(fā)病率顯著低于攜帶三個(gè)原發(fā)突變的高加索人群[18]。我們對(duì)6例先證者進(jìn)行眼底檢查發(fā)現(xiàn)，這6例患者眼底均有不同程度的改變，部分患者眼底全部或部分蒼白，符合視神經(jīng)萎縮期的表現(xiàn)，也有部分患者視盤(pán)周?chē)苡厍?，視網(wǎng)膜水腫，為急性期表現(xiàn)[19]。研究顯示，RNFL厚度在顳側(cè)變化比較明顯，顳側(cè)纖維是最早和受累最嚴(yán)重的纖維，發(fā)病早期或臨床前期，顳側(cè)視盤(pán)黃斑束纖維水腫導(dǎo)致RNFL厚度增加，當(dāng)病程超過(guò)6個(gè)月時(shí)，LHON處于萎縮期，此時(shí)，RNFL的厚度在各象限均變薄[20-24]。本研究中的2例重度視力損傷患者，其RNFL厚度已經(jīng)明顯變薄，而其他4例患者RNFL厚度無(wú)明顯變化。

我們對(duì)6例先證者線粒體基因組全序分析發(fā)現(xiàn)均攜帶m.3497C＞T突變，該突變?yōu)橐褕?bào)道的與LHON相關(guān)的繼發(fā)突變位點(diǎn)[18]。此外，m.3635G＞A、m.T12338T＞C、m.T14502＞C突變也能增加由m.G11778＞A突變所致LHON的臨床表型[10，13，16]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了7個(gè)未報(bào)道的位點(diǎn)，分別為：D-Loop區(qū)268C＞T突變位點(diǎn)；ND1基因3435C＞T、3488T＞C、3632C＞T突變位點(diǎn)；ND2基因5057C＞T突變位點(diǎn)；NC區(qū)5895DelC突變位點(diǎn)和ND3基因10250A＞G突變位點(diǎn)。D-Loop區(qū)和NC區(qū)為非編碼區(qū)，ND1基因3435C＞T，ND2基因5057C＞T和ND3基因10250A＞G突變位點(diǎn)突變后，并沒(méi)有造成氨基酸的改變，故認(rèn)為以上幾種突變位點(diǎn)不是LHON表型發(fā)生的主要原因[25]。進(jìn)一步對(duì)ND1基因3488T＞C和3632C＞T突變位點(diǎn)種系發(fā)育分析顯示，在種族發(fā)育過(guò)程中這兩個(gè)位點(diǎn)的保守型均＞75%[25]，可能協(xié)同m.3497C＞T突變位點(diǎn)致病。有研究顯示，線粒體單體型B可能增加耳聾及高原型肺水腫的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[26-27]。單體型D4j和M9a等在LHON的發(fā)病中起著重要作用[28-30]，這6例先證者線粒體單體型中5例為B4c型，我們推測(cè)單體型B4c可能協(xié)同影響LHON的發(fā)病。

ND1基因3635G＞A突變引起的線粒體蛋白質(zhì)合成障礙導(dǎo)致線粒體氧化呼吸鏈復(fù)合體損傷，引起呼吸鏈復(fù)合物酶活性的改變，并直接影響了氧化呼吸效率[13]。本研究對(duì)6例攜帶m.3497C＞T突變的轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞株呼吸鏈復(fù)合物酶活性分析發(fā)現(xiàn)，突變的細(xì)胞株其復(fù)合物I酶活性為對(duì)照細(xì)胞株的87.61%，各個(gè)細(xì)胞株復(fù)合體II、復(fù)合體III和復(fù)合體IV活性無(wú)顯著差別，這說(shuō)明m.3497C＞T突變影響了呼吸鏈復(fù)合物I的酶活性。

隨著研究手段的增加，越來(lái)越多的新位點(diǎn)及繼發(fā)位點(diǎn)的功能進(jìn)一步得到驗(yàn)證，使得LHON的發(fā)病機(jī)制得到進(jìn)一步闡明。本研究對(duì)攜帶m.3497C＞T突變的患者臨床表型分析、眼底檢查以及生化功能研究，結(jié)果均提示m.3497C＞T突變是這些家系發(fā)病的主要原因。因此，可將m.3497C＞T突變作為L(zhǎng)HON易感人群的篩查位點(diǎn)，對(duì)攜帶該突變的攜帶者進(jìn)行及時(shí)宣教并進(jìn)行有效地預(yù)防。