醫(yī)學(xué)院校流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)平臺(tái)技術(shù)開(kāi)發(fā)和研究生實(shí)驗(yàn)教學(xué)應(yīng)用實(shí)踐的探討

謝旦立，鄭蒙蒙，鄭斌嬌，樓永良

（溫州醫(yī)科大學(xué)，溫州 325035，1.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院；2.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

流式細(xì)胞儀是一種多參數(shù)條件下快速分析和精確分選細(xì)胞的現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研儀器。隨著流式細(xì)胞儀、熒光探針?lè)N類(lèi)和熒光探針標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，流式細(xì)胞儀的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍不斷被拓展，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和材料學(xué)等不同學(xué)科和技術(shù)領(lǐng)域[1-8]。因此，流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)已成為各大院校、高水平醫(yī)院和科研院所科研技術(shù)平臺(tái)的重要組成[9]。

目前，全球商業(yè)化的流式細(xì)胞儀主要分兩類(lèi)：一類(lèi)以分析功能為主，應(yīng)用于臨床檢測(cè)及常規(guī)科研，一般具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易掌握的優(yōu)點(diǎn)；另一類(lèi)是具有高速分選功能的高端科研型，研發(fā)趨勢(shì)是越來(lái)越多的熒光檢測(cè)參數(shù)和越來(lái)越快的分選速度。相比分析型流式，這類(lèi)產(chǎn)品一般來(lái)說(shuō)操作較復(fù)雜，難掌握。作為醫(yī)學(xué)院校，溫州醫(yī)科大學(xué)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)我校）目前也已裝備多臺(tái)流式細(xì)胞儀，包括BD FACS AriaII（分析/分選型）、BECKMAN COULTER Moflo XDP（分析/分選型）、BECKMAN COULTER CytoFLEX（分析型）和BD Accuri C6（分析型）等，并在醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)等本科生課程、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)等碩士研究生課程中開(kāi)設(shè)了流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)和理論課，旨在培養(yǎng)學(xué)生對(duì)流式細(xì)胞術(shù)理論、操作和應(yīng)用能力的有效結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)是目前生物醫(yī)學(xué)科研平臺(tái)必不可缺的技術(shù)，開(kāi)設(shè)研究生流式細(xì)胞課程和技術(shù)培訓(xùn)，將為研究生今后從事相關(guān)科研工作提供技術(shù)保障。因此，隨著流式細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，如何建設(shè)好流式細(xì)胞技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，如何提供多樣化和高水平的流式細(xì)胞應(yīng)用及深度開(kāi)發(fā)現(xiàn)有平臺(tái)的技術(shù)服務(wù)項(xiàng)目等一系列問(wèn)題，越來(lái)越受到高校和各類(lèi)科研院所的關(guān)注。筆者結(jié)合流式細(xì)胞儀使用的心得，探討流式細(xì)胞儀在實(shí)驗(yàn)教學(xué)和技術(shù)平臺(tái)建設(shè)等方面的應(yīng)用。

1 積極引入前沿流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)和解決方案

目前，國(guó)內(nèi)多數(shù)醫(yī)學(xué)院校流式本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)主要在免疫學(xué)及其相關(guān)的實(shí)驗(yàn)課等課程中涉及，內(nèi)容包括講解流式細(xì)胞儀的原理、方法、步驟和應(yīng)用等[10-13]。從1980年北京師范大學(xué)生物系引進(jìn)國(guó)內(nèi)第一臺(tái)流式細(xì)胞儀（BD FACSIII）以來(lái)，國(guó)內(nèi)的流式細(xì)胞儀裝機(jī)總量和應(yīng)用水平已經(jīng)有長(zhǎng)足的發(fā)展與進(jìn)步，其中大部分裝機(jī)的流式細(xì)胞儀以分析型為主。隨著我們國(guó)家對(duì)基礎(chǔ)科研的不斷重視及高水平研究成果的不斷涌現(xiàn)，流式細(xì)胞儀的綜合應(yīng)用已不局限于細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡或兩色、三色和四色等。而流式細(xì)胞儀在這30年里也快速發(fā)展，包括激光器種類(lèi)和數(shù)量、可檢測(cè)的熒光類(lèi)型和數(shù)量、品牌種類(lèi)、各種專(zhuān)利技術(shù)等方面的不斷進(jìn)步。因此，為適應(yīng)流式細(xì)胞技術(shù)日新月異的發(fā)展，幫助學(xué)生拓展科研思路，亟需在醫(yī)學(xué)院校研究生培養(yǎng)中引入前沿的流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)，開(kāi)發(fā)在新時(shí)期下與時(shí)俱進(jìn)的流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)。

根據(jù)我校目前的科研需要，我們以科研平臺(tái)BD FACS AriaII流式細(xì)胞儀為例，主要列舉：①基于多色分析的Carboxyfluorescein succinimidyl ester（CFSE）標(biāo)記法和Bromodeoxyuridine（BrdU）摻入法的細(xì)胞增殖功能檢測(cè)；②基于多色分析的體內(nèi)細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化水平檢測(cè)；③基于多色分析的細(xì)胞因子多因子檢測(cè)；④基于BD Index分選功能的快速細(xì)胞單克隆化及在研究生培養(yǎng)中的應(yīng)用。

1.1 基于多色分析的CFSE標(biāo)記法和BrdU摻入法的細(xì)胞增殖功能檢測(cè) 細(xì)胞增殖功能檢測(cè)是目前細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的常見(jiàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法。常規(guī)的方法包括MTT法、CCK-8法和細(xì)胞周期法等，但存在靈敏度較低、操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)結(jié)果不夠直觀和教學(xué)效果較差等問(wèn)題。在科研工作中，我們采用CFSE標(biāo)記法來(lái)跟蹤被標(biāo)記體外培養(yǎng)細(xì)胞的分裂增殖情況，并在臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)、生物學(xué)和免疫學(xué)專(zhuān)業(yè)碩士研究生的流式細(xì)胞技術(shù)理論或?qū)嵺`中進(jìn)行推廣應(yīng)用，以替換上述傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法，拓寬相關(guān)專(zhuān)業(yè)研究生對(duì)體外檢測(cè)細(xì)胞增殖功能技術(shù)的認(rèn)識(shí)面。多參數(shù)分析條件下的CFSE標(biāo)記法相比傳統(tǒng)MTT等方法在檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞的分裂增殖功能中具有結(jié)果更直觀、更全面的優(yōu)點(diǎn)，如可同時(shí)檢測(cè)混合培養(yǎng)細(xì)胞中特定細(xì)胞亞群雙參數(shù)（細(xì)胞因子表達(dá) vs.分裂增殖、細(xì)胞存活率 vs. 分裂增殖）下細(xì)胞增殖與其他細(xì)胞功能事件關(guān)系等（見(jiàn)圖1-2）。此外，由于MTT和CCK-8法無(wú)法直接檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞的分裂增殖能力，我們將BrdU腹腔注射實(shí)驗(yàn)小鼠，利用BrdU摻入法追蹤小鼠體內(nèi)特定類(lèi)型細(xì)胞的分裂增殖功能情況（見(jiàn)圖3）。通過(guò)將CFSE標(biāo)記和BrdU摻入法引入相關(guān)專(zhuān)業(yè)研究生的流式細(xì)胞技術(shù)理論和科研實(shí)驗(yàn)技能培訓(xùn)中，使流式細(xì)胞技術(shù)的實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容更貼近于科研，拓寬流式細(xì)胞技術(shù)服務(wù)的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活化后小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞CFSE/IL-2雙參數(shù)分析細(xì)胞增殖與IL-2表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活化后小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞CFSE/細(xì)胞死活染料雙參數(shù)分析細(xì)胞增殖與細(xì)胞存活率關(guān)系的示意圖

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌感染小鼠對(duì)肝巨噬細(xì)胞分裂增殖能力影響

1.2 基于多色分析的體內(nèi)細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化水平檢測(cè) 傳統(tǒng)的檢測(cè)細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化水平的實(shí)驗(yàn)方法主要通過(guò)Western blot，耗時(shí)較長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，需采用內(nèi)參蛋白進(jìn)行定量分析，且無(wú)法分析混合細(xì)胞樣品中某一群細(xì)胞蛋白質(zhì)的磷酸化水平。通過(guò)熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞磷酸化抗體，并采用胞內(nèi)染色的方法，流式細(xì)胞技術(shù)可檢測(cè)大多數(shù)胞內(nèi)蛋白磷酸化水平，且染色過(guò)程通?？梢栽? d內(nèi)完成，且無(wú)需內(nèi)參即可比較不同樣本或同一混合細(xì)胞樣本中不同群細(xì)胞某一蛋白磷酸化水平的差異，大幅縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間（見(jiàn)圖4）。因此，開(kāi)展該技術(shù)的教學(xué)，可提高相關(guān)專(zhuān)業(yè)研究生對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化檢測(cè)的認(rèn)識(shí)，使其在科研工作中能有的放矢地選擇最優(yōu)的方法來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化的檢測(cè)，充分調(diào)動(dòng)科研的主觀能動(dòng)性，培養(yǎng)創(chuàng)新意識(shí)和創(chuàng)新能力，提高科研實(shí)踐能力。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌感染小鼠對(duì)肝中性粒細(xì)胞AKT磷酸化的影響

1.3 基于多色分析的細(xì)胞因子多因子檢測(cè)的應(yīng)用細(xì)胞因子主要具有免疫調(diào)節(jié)等作用，與許多疾病的發(fā)生密切有關(guān)。細(xì)胞因子種類(lèi)繁多，對(duì)于某一種細(xì)胞因子表達(dá)的檢測(cè)，以往的方法主要通過(guò)ELISA法進(jìn)行定量測(cè)定，耗時(shí)長(zhǎng)，通量小，一次僅能檢測(cè)一種細(xì)胞因子。隨著B(niǎo)D公司和BioLegend公司等相繼推出細(xì)胞因子多因子檢測(cè)試劑盒后，一般可同時(shí)檢測(cè)10種以上細(xì)胞因子的表達(dá)量，該法結(jié)合ELISA和流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，待測(cè)因子選擇靈活，研究人員可根據(jù)研究需要自由組合和定制檢測(cè)指標(biāo)，檢測(cè)范圍寬，靈敏度高，樣品用量少，一般僅需25 μL以下，且可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。我們采用了BioLegend公司的LEGENDplex細(xì)胞炎癥因子檢測(cè)（13因子）試劑盒，其能通過(guò)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)定量分析TNF-α、IFN-γ和IL-1β等13種細(xì)胞因子的表達(dá)（見(jiàn)圖5）。該試劑盒主要通過(guò)熒光微球技術(shù)的免疫“雙夾心”液相檢測(cè)方法，其中13種微球偶聯(lián)有對(duì)應(yīng)的13種細(xì)胞因子的生物素化的捕獲抗體，同時(shí)帶有不同強(qiáng)度APC熒光，并根據(jù)其大小分為A、B兩群，通過(guò)捕獲樣品中相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子，再通過(guò)鏈親和素-PE反應(yīng)，檢測(cè)APC和PE雙信號(hào)來(lái)讀取13種細(xì)胞因子的表達(dá)情況。該法的理論和實(shí)踐教學(xué)可使研究生，尤其是科研課題涉及免疫相關(guān)技術(shù)的研究生在了解常規(guī)ELISA和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基本原理的基礎(chǔ)上，將兩者知識(shí)點(diǎn)有機(jī)連貫起來(lái)，并靈活結(jié)合到具體的科研實(shí)驗(yàn)中，實(shí)現(xiàn)人員培訓(xùn)與前沿應(yīng)用之間的有效融合。

圖5 BioLegend多因子流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒（13因子）細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)示意圖

1.4 基于BD克隆分選功能的快速細(xì)胞克隆化 細(xì)胞的克隆化是目前許多生物醫(yī)學(xué)課題中構(gòu)建各類(lèi)基因工程改造細(xì)胞株所必需的過(guò)程。傳統(tǒng)的方法采用有限稀釋法同時(shí)結(jié)合抗生素篩選，該法耗時(shí)長(zhǎng)。我們采用BD FACS AriaII分選模塊的克隆分選功能（也稱(chēng)索引分選），將轉(zhuǎn)染后的單細(xì)胞分選至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)培養(yǎng)后可快速獲得多個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，大大縮短篩選時(shí)間（見(jiàn)圖6）。

圖6 BD FACS AriaII Index sorting模式示意圖

因此，我們通過(guò)利用CRISPR-Cas9技術(shù)細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)，對(duì)相關(guān)專(zhuān)業(yè)的研究生進(jìn)行從質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞克隆分選整個(gè)過(guò)程（見(jiàn)圖7）的理論、實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)。該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)，在體系上適合研究生較全面地理解和掌握細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)基本技術(shù)的同時(shí)，將流式細(xì)胞術(shù)真正融入到具體的案例中，發(fā)揮該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，不僅能夠更好地幫助研究生理解流式細(xì)胞克隆分選技術(shù)的重要性，更是培養(yǎng)和鍛煉他們科學(xué)思考能力，學(xué)會(huì)如何科學(xué)有效地選用合適高效的方法設(shè)計(jì)完成科研課題。此外，對(duì)于儀器應(yīng)用而言，此類(lèi)涉及較多知識(shí)點(diǎn)的大型實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中技術(shù)和知識(shí)覆蓋面廣，涵蓋了從分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等方法，并包括有細(xì)胞培養(yǎng)、分子克隆和轉(zhuǎn)染、流式細(xì)胞無(wú)菌樣本制備等步驟和技能。此類(lèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)苠憻捬芯可鷮?duì)利用流式細(xì)胞技術(shù)全程綜合設(shè)計(jì)科研方案能力，培養(yǎng)研究生的科研創(chuàng)新意識(shí)和探索科研的興趣。

2 流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)建設(shè)與研究生實(shí)踐教學(xué)的思考

圖7 利用BD FACS AriaII Index sorting功能和CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)快速獲得突變細(xì)胞株克隆的示意圖

流式細(xì)胞術(shù)已進(jìn)入科研和臨床工作的各個(gè)方面，醫(yī)學(xué)院校研究生對(duì)流式細(xì)胞技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用了解較少，限制了流式細(xì)胞技術(shù)在研究生科研和臨床工作中的應(yīng)用。因此，醫(yī)學(xué)院校研究生中系統(tǒng)開(kāi)展流式細(xì)胞技術(shù)理論和實(shí)踐訓(xùn)練刻不容緩：一方面，作為平臺(tái)建設(shè)而言，流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)服務(wù)的對(duì)象主要是科研人員，以科研需求推動(dòng)流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)建設(shè)及人員培訓(xùn)，可較大程度搭建適合本單位的流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)；另一方面，包含流式細(xì)胞多色分析和高端分選兩塊內(nèi)容的綜合性實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目，是提供高水平生物醫(yī)學(xué)研究服務(wù)的重要手段。以高水平技術(shù)建設(shè)高質(zhì)量平臺(tái)，以高質(zhì)量教學(xué)和科研技術(shù)平臺(tái)促進(jìn)研究生教學(xué)質(zhì)量不斷提高等一系列形式，提高流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)的水平、培養(yǎng)研究生對(duì)流式細(xì)胞技術(shù)的動(dòng)手操作能力，為流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)建設(shè)和研究生職業(yè)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

此外，考慮到目前流式細(xì)胞儀型號(hào)和品牌較多，高端機(jī)型為各廠家重點(diǎn)推薦的儀器。不論高端還是低端型號(hào)，機(jī)器不會(huì)思考問(wèn)題，最為重要的還是操作人員。在選擇合適流式細(xì)胞儀時(shí)需充分調(diào)研，綜合各型號(hào)的突出優(yōu)點(diǎn)和不足之處，尤其是是否能緊密?chē)@本單位科研工作需求，是否能對(duì)本單位現(xiàn)有技術(shù)平臺(tái)起重要提升作用為主要考量標(biāo)準(zhǔn)之一。緊密跟蹤和開(kāi)展流式細(xì)胞技術(shù)的前沿應(yīng)用，尤其是對(duì)已有儀器功能和應(yīng)用的不斷開(kāi)發(fā)，才能提升平臺(tái)技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有儀器性能的熟悉和了解，并可大幅度提高大型儀器利用率，最大程度發(fā)揮現(xiàn)有儀器的資源優(yōu)勢(shì)、技術(shù)應(yīng)用范圍和師資特長(zhǎng)，還可提高研究生的科研專(zhuān)業(yè)訓(xùn)練水平，有助于其今后真正將流式細(xì)胞技術(shù)運(yùn)用于自己的科研和臨床工作中。