疏清顆粒質(zhì)量標準提高研究

車宏偉 楊海寧 王登才 鄭穩(wěn)生

中國醫(yī)學科學院藥物研究所藥物傳輸技術(shù)及新型制劑北京市重點實驗室，北京 100050

疏清處方是以經(jīng)典名方“白虎湯”為基礎(chǔ)加減而長期應(yīng)用的方劑，由生石膏、大青葉、桑葉、蘆根、甘草組成，具有清熱解毒、宣泄?jié)櫡蔚裙π1-2]，臨床用于小兒外感風熱、上呼吸道感染等療效顯著，但因疏清顆粒開發(fā)較早，制備工藝落后，相關(guān)標準較低，難以控制藥品質(zhì)量。本研究通過定性、定量法對疏清顆粒質(zhì)量進行全面考察，以期提高質(zhì)量標準，為藥品生產(chǎn)檢驗提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA423S-CW分析天平；SHB-Ⅲ循環(huán)水泵；HH-S恒溫水浴鍋；DTC-27超聲儀；硅膠G、GF254薄層板；ZF-C三用紫外分析儀；日立chromaster 5430液相；DAD檢測器。

1.2 試藥

大青葉（批號：121367-201403）、甘草（批號：120925-201109）、蘆根（批號：121107-201505）、桑葉（批號：121123-201305）、靛玉紅（批號：110717-200204）購買于中國食品藥品檢定研究院；甘草酸單銨鹽（上海古朵生物科技有限公司，批號：X4860010）；甘草苷（上海古朵生物科技有限公司，批號：C21H2209）；疏清顆粒（吉林華康藥業(yè)，批號：20171213、20171230、20180305）；娃哈哈純凈水；鹽酸；高效液相色譜（HPLC）甲醇（Fisher），其他試劑均為分析級。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

2.1.1 桑葉 取本品各3 g，研磨，加三氯甲烷-甲醇（2∶3）50 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取桑葉對照藥材2 g，同法制成對照藥材溶液。除去桑葉，模擬處方，采用完全相同方法制備陰性對照液。照2015年版 《中國藥典（四部）》通則 0502[3]試驗，吸取上述 3 種溶液各 4 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（4.8∶5.5∶1.1）為展開劑，展開，取出，晾干。 噴以3%氫氧化鈉溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視[4]。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點（圖中箭頭所示）。陰性對照色譜相應(yīng)的位置上，未見任何斑點，表明該鑒別專屬性強，具較好的重現(xiàn)性。見圖1。

圖1 桑葉薄層色譜圖譜

2.1.2 甘草 取本品各5 g，加甲醇50 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，置分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，再以1%氫氧化鈉溶液萃取2次[5]，每次20 mL，合并堿液，用鹽酸調(diào)pH值至中性，用水飽和正丁醇萃取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，以20 mL水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1 g，加乙醚 40 mL[6]，回流 1 h，濾過，藥渣加甲醇 30 mL，回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水40 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇溶液，用水洗滌3次，每次10 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取甘草苷，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。除去甘草，模擬處方，采用完全相同的方法制備陰性溶液，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一GF254薄層板上，用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）作為展開劑[7-8]，展開，取出晾干，在紫外光燈（254 nm）下進行檢視。供試品色譜中在與對照藥材和對照品在相同位置顯示相同顏色的斑點，在與陰性對照色譜中相應(yīng)的位置上，未見任何斑點，表明該薄層鑒別專屬性強，重現(xiàn)性好。見圖2。

圖2 甘草薄層色譜圖譜

2.1.3 大青葉 取靛玉紅對照品，加三氯甲烷制成0.1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液，取大青葉對照藥材1 g加三氯甲烷50 mL超聲30 min，濾過，揮干濾液，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。除去大青葉，模擬處方，采用完全相同的方法制備陰性溶液。吸取對照品溶液、對照藥材溶液及鑒別項“2.1.1”下的供試品溶液、陰性溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑，展開，取出晾干，在日光下檢識[9]。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點（圖中箭頭所示），陰性色譜中相應(yīng)的位置上，未見任何斑點，表明該薄層鑒別專屬性強，重現(xiàn)性好。見圖3。

圖3 大青葉薄層色譜圖譜

2.1.4 蘆根 取本品各10 g，加三氯甲烷回流提取2次，每次50 mL，濾過，合并濾液，回收溶劑，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取蘆根對照藥材1 g，加三氯甲烷25 mL，超聲30 min[10]，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解。除去蘆根，模擬處方，采用完全相同的方法制備陰性溶液，分別吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（4.5∶1.5）為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸-乙醇試液，105℃加熱后，置紫外燈（365 nm）下[11]檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點（圖中箭頭所示），在與陰性對照色譜中相應(yīng)的位置上，未見任何斑點，表明該鑒別專屬性強，重現(xiàn)性好。見圖4。

圖4 蘆根薄層色譜圖譜

2.2 含量測定

2.2.1 測定制劑中靛玉紅（A）、甘草苷（B）的含量 色譜條件：流動相A比B=甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液（33.5∶33.5∶33）比乙腈-冰醋酸 0.05%（60∶40）[12]；檢測波長A比B=289 nm比238 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35℃，進樣量 10 μL。

2.2.2 樣品溶液配制 A對照品溶液：精密稱取A對照品，加三氯甲烷-甲醇（7∶3，V/V）[13]制成約 12 μg/mL 的溶液，搖勻，再精密吸取10 mL，加甲醇制成約12 μg/mL的溶液，即得。B對照品溶液：精密稱取B對照品，加甲醇制成約1 mg/mL的溶液。供試品溶液A：取3批本品，取1.5 g，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲30 min，放冷，加甲醇至刻度，即得。供試品溶液B：取3批本品，取1.5 g，置100 mL錐形瓶中，加8%鹽酸溶液30 mL，再加三氯甲烷30 mL，回流提取1 h[14]，放冷，置分液漏斗中，取三氯甲烷層液，酸液用三氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，揮干溶劑，殘渣加甲醇至10 mL量瓶，即得。

2.3 A方法學建立

2.3.1 專屬性實驗 分別精密吸取供試品溶液，大青葉陰性對照溶液，A對照品溶液，注入HPLC儀測定，結(jié)果表明，大青葉陰性對照無干擾，專屬性良好。

2.3.2 標準曲線的制備 精密吸取“2.2”項下A對照品溶液 2、4、8、10、12、16 μL，分別進樣測定，以對照品含量為橫坐標，以峰面積值為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程 y=1471.2799x-52.6798（r＝ 0.9992），結(jié)果表明靛玉紅在0.057～0.46 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，符合外標法要求。

2.3.3 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測得峰面積RSD為1.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2”項下供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、6、12、24 h，按同項下的色譜條件測定，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 重復性試驗 取本品（批號：20171213），6份，各1.5 g，精密稱定，置 50 mL錐形瓶中，按“2.2”項下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得。表明本方法重復性良好。

2.3.6 回收率試驗 取本品（批號：20171213），6份，各20 g，加入一定量的對照品，按“2.2”項下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得。見表1。

表1 靛玉紅回收率試驗

2.3.7 疏清顆粒三批小試含量測定 取三批樣品各1.5 g，按“2.2”項下供試品溶液制備方法制備，測定結(jié)果見表2。

表2 疏清顆粒三批小試含量測定（μg/g）

2.4 B方法學建立

2.4.1 B專屬性實驗 分別精密吸取供試品溶液，甘草陰性對照溶液、B對照品溶液，注入HPLC儀測定。結(jié)果表明甘草陰性無干擾，專屬性良好。

2.4.2 標準曲線的制備 精密吸取“2.2”項下B對照品儲備液，置于容量瓶中，加甲醇制成 0.02、0.04、0.08、0.1、0.12、0.14 mg/mL的溶液測定，以含量為橫坐標，以峰面積值為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程y=356 584x-2427.7（r＝ 0.9995），結(jié)果表明甘草苷在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)線性良好，符合外標法要求。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下供試品溶液，按同一項下色譜譜條件，連續(xù)進樣6次，峰面積RSD為1.05%，表明精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2”項下供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、6、12、24 h 測定，峰面積 RSD 為0.96%（n=6）<2%，表明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.5 重復性試驗 取本品（批號：20171213）6份，各1.5 g，置50 mL錐形瓶中，按“2.2”項下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得，表明本方法重復性良好。

2.4.6 回收率試驗 取本品（批號：20171213）6份，各20 g，加入一定量的對照品，按“2.2”項下供試品制備方法制備，取續(xù)濾液，即得。測定結(jié)果見表3。

表3 甘草苷回收率試驗

2.4.7 疏清顆粒三批小試含量測定 稱取三批樣品各1.5 g，按“2.2”項下供試品制備方法制備。測定結(jié)果見表4。

表4 疏清顆粒三批小試含量測定結(jié)果（μg/g）

3 討論

TLC廣泛用于中藥材、提取物、制劑等質(zhì)量的定性鑒別，隨著檢測技術(shù)的不斷精密化，目前質(zhì)量控制多偏向于液相[15]、氣相[16]等技術(shù)的使用，但TLC因價格低廉，實驗迅速仍被廣泛地應(yīng)用于藥物研發(fā)中。

桑葉鑒別中，分別比較了三氯甲烷、甲醇等不同溶劑的提取效果，最終以三氯甲烷-甲醇（2∶3）超聲30 min 提取最完全，以甲苯-三氯甲烷-丙酮（4.8∶5.5∶1.1）為展開劑，Rf值適中，各斑點清晰無拖尾。

蘆根具有清熱瀉火、生津止渴之功效[17]，回流提取優(yōu)于超聲提取，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（5.2∶1.5）為展開劑，分離效果較好，Rf值適中，且陰性無干擾。

原標準中靛玉紅為質(zhì)控指標，但對大青葉未做薄層鑒別，本文補充大青葉的TLC鑒別。因靛玉紅屬雙吲哚類生物堿[18]，在乙醚、三氯甲烷中溶解度高，故采用三氯甲烷富集。因靛玉紅本身是紫紅色，TLC鑒別時在日光下顏色明顯，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1）為展開劑，陰性無干擾。原標準中有石膏的鑒別、檢測項，本文通過驗證，甘草中含有草酸鈣方晶[19-20]，陰性有干擾因此舍棄。分別考察甲醇-乙腈-水系統(tǒng)的檢測效果，發(fā)現(xiàn)在相同色譜條件下，各自分離度較佳，但都有拖尾現(xiàn)象，加入磷酸、冰醋酸，拖尾改善。

本研究通過TLC對疏清顆粒全方中藥材進行鑒別，新增桑葉、蘆根、大青葉等鑒別項，甘草苷為質(zhì)控項。結(jié)果表明本法簡單易行，斑點清晰，分離度好、重復性好，專屬性強且斑點清晰，陰性無干擾；所建立的疏清顆粒質(zhì)量標準高于原標準，提高了疏清顆粒的質(zhì)量，為以后質(zhì)量控制提供依據(jù)。