ABT199通過增加Drp-1依賴的線粒體分裂誘導人皮膚鱗癌A431細胞凋亡

袁勝華，張玉榮，李浩運，宋靜卉

皮膚癌是臨床上比較常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著人們的生命和健康。皮膚癌的主要病理類型為：基底細胞癌、惡性黑色素瘤和鱗狀細胞癌等。其中鱗狀細胞癌最為常見[1]。研究顯示抗凋亡蛋白Bcl-2在鱗狀細胞癌中高表達，促進細胞存活并降低其對凋亡反應的敏感性[2]。Bcl-2家族成員主要包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，分別促進或抑制細胞死亡?？沟蛲龅鞍字饕˙cl-2、Bcl-xL和Mcl-1等，促凋亡蛋白主要包括Bax、Bak、Bim和Bid等[3]。其中抗凋亡蛋白Bcl-2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮著重要作用，并充當著一個“凋亡開關”的功能。線粒體是Bcl-2家族蛋白的主要作用靶點之一，最新研究表明其除了調控線粒體外膜通透性外，也調控線粒體動力學（線粒體融合和分裂）[4]。

ABT199是一種高效的特異性Bcl-2抑制劑，具有良好的抗腫瘤效應，并且不會引起血小板的減少[5,6]。Fan等[7]研究已證實Bcl-2抑制劑通過增加線粒體分裂可增加人膽管癌細胞對順鉑的敏感性。然而目前關于ABT199在人皮膚鱗狀細胞癌凋亡中的作用研究甚少。本研究采用鱗癌A431細胞為研究對象，從體外水平觀察ABT199對A431細胞活性和凋亡的影響并探討其分子機制，旨在揭示ABT199通過增加線粒體分裂誘導A431細胞凋亡的新機制，從而為鱗癌的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人皮膚鱗狀細胞癌細胞系A431購買于中國科學院細胞所，DMEM（高糖）培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。ABT199由Med Chem Express公司提供。線粒體分裂抑制劑-1 （mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）購自Selleck Chemicals公司。Mito-Tracker Red購自Invitrogen公司。Muse?細胞分析儀、Muse凋亡試劑盒和Muse線粒體膜電位試劑盒購自Merck Millipore公司。線粒體提取試劑盒、ECL發(fā)光顯色液購自碧云天公司。線粒體分裂蛋白（mitochondrial dynamin-related protein-1，Drp-1）抗體、線粒體內參抗體（COX IV）抗體、β-actin抗體、cleaved caspase-3抗體、cleaved caspase-9抗體及其對應二抗均購自Proteintech 公司。聚二偏氟乙烯板（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.45 μm）購自Millipore公司。Nacl和無水乙醇等常規(guī)化學試劑購自北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、傳代 使用完全型DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)A431細胞系，放入37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱。根據(jù)細胞生長情況及培養(yǎng)基顏色更換培養(yǎng)液或傳代。當細胞生長至80%左右融合時棄去培養(yǎng)基，使用已經(jīng)高壓滅菌的1×磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗細胞2次，棄去PBS，加入37 ℃預熱的0.04%胰蛋白酶（簡稱胰酶）消化細胞。然后將培養(yǎng)瓶放入孵箱中，期間間斷取出培養(yǎng)瓶觀察，當細胞失去彼此間連接，從多角形逐漸變圓后加入DMEM培養(yǎng)液以終止胰蛋白酶的消化，使用吸管吹打細胞，直至細胞完全被吹下來。將細胞懸液移至離心管中。室溫下800 r/min，離心5 min，有效離心半徑15 cm。棄去上清液，按照1∶3～1∶5比例傳代至新的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細胞的活力 取對數(shù)生長期A431細胞進行實驗。將收集到的細胞沉淀用培養(yǎng)基重懸，調整細胞數(shù)為8×104個/ml，每孔100 μl接種于96孔板中，實驗設1個陰性對照和8個藥物濃度，每一濃度均設5個復孔，周圍孔用無菌的PBS填充。37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育。次日，對照孔更換培養(yǎng)基，8個加藥孔分別用DMEM配制不同濃度的ABT199（1.25 μM、2.5 μM、5 μM、7.5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM）工作液，加藥完成后，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入20 μl MTT （5 mg/ml），繼續(xù)孵育4 h，用1 ml注射器小心吸去上清，每孔加入二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μl，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測570 nm波長下各孔的吸光度（OD值）。實驗重復3次，計算細胞活性=（1－加藥孔OD值/對照孔OD值）×100%。根據(jù)實驗結果，以藥物濃度為橫軸，細胞活性為縱軸，繪制細胞活性變化曲線，計算細胞活性抑制率達到50%時的藥物劑量（IC50）作為后續(xù)實驗用藥濃度。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期的A431細胞接種于24 孔板中，接種濃度約為4×104個細胞/孔，加入不同濃度的ABT199作用24 h，胰酶消化，收集細胞，800 r/min，離心5 min，有效離心半徑15 cm，然后棄去上清液，緩緩加入適量無血清 DMEM培養(yǎng)液（調整細胞濃度細胞濃度約為1×106/ml），用手指輕彈將細胞懸液混勻，將細胞懸液與Muse?Annexin-V凋亡細胞檢測試劑 1∶1 混勻，室溫避光孵育25 min，處理好的樣本用Muse?細胞分析儀進行檢測，分析不同處理組中細胞凋亡率的變化。

1.2.4 共聚焦顯微鏡檢測線粒體分裂對數(shù) 生長期A431細胞按照4×104個/孔接種于24孔板（提前把高壓過的1 cm2蓋玻片放入其中）內，37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞達到70%融合時，10 μM ABT737和/或Mdivi-1作用24 h。棄掉培養(yǎng)液，將細胞用0.1 M PBS洗3次后。MitoTracker Red 250 μM作用于細胞30 min。棄掉染色液，將細胞用0.1 M PBS洗3次，每次3 min。隨后用1∶500稀釋好的Hoechst33342染料孵育2 min。0.01% Triton 0.01 M PBS洗3次，5 min/次。小心將細胞面朝下放置在準備好的載玻片上，利用水性封片劑（甘油∶雙蒸水=1∶9）封片，注意避光。共聚焦顯微鏡下采集圖像。MitoTracker Red激發(fā)波長575 nm，發(fā)射波長590 nm。

1.2.5 Western blot檢測caspase-3和caspase-9的活化及Cyto C和Drp-1的線粒體移位 ABT737和/或Mdivi-1處理A431細胞24 h后，提取全細胞蛋白或通過碧云天試劑盒分離線粒體蛋白和胞漿蛋白。Bradford法測蛋白濃度，取待測樣本按30 μg上樣，15%二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)電泳、將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉、一抗4℃過夜，二抗溫育2 h，用0.01 mol/L的PBS洗膜3次，1次15 min，2次5 min，加增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色液進行顯影。數(shù)據(jù)采用天能圖像分析系統(tǒng)及Quantity One軟件進行分析。

1.2.6 流式細胞術檢測線粒體膜電位 不同藥物處理后，常規(guī)培養(yǎng)6 h。用胰酶消化細胞，隨后800 r/min、離心5 min，有效離心半徑15 cm，并用100 μl 培養(yǎng)液重懸。取細胞懸液100 μl和MitoPotential dye染料95 μl放入1.5 ml 環(huán)氧樹脂（epoxide，EP）管，并輕微混勻，37℃避光孵育20 min。再向EP管中加入5 μl的7-氨基放線菌素（7-aminoactinomycin D，7-AAD），室溫避光孵育5 min。Muse流式細胞儀檢測各組細胞的線粒體膜電位變化情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ABT199對A431細胞活性的影響 由圖1 MTT結果可知，ABT199能以劑量依賴的方式抑制A431細胞活力（P＜0.05），24 h的IC50值為（10.33±0.93）μM。因此，本研究選用3個濃度梯度的ABT199（5 μM、10 μM、15 μM）作用細胞24 h。流式細胞術結果進一步表明ABT199可誘導A431細胞的凋亡（P＜0.05，圖2）。

2.2 ABT199對線粒體長度變化的影響 共聚焦顯微鏡結果顯示ABT199能誘導線粒體長度減短，說明ABT199能誘導A431細胞發(fā)生線粒體分裂；而Mdivi-1可減弱ABT199誘導的線粒體分裂（圖3）。Western blot結果顯示ABT199誘導A431細胞胞漿蛋白中Drp-1表達下降，而線粒體蛋白中Drp-1表達上升（圖4）。

2.3 ABT199誘導A431細胞線粒體途徑的凋亡 流式細胞術結果表明ABT199能誘導A431細胞線粒體膜電位（△Ψm）下降（圖5），而與ABT199組相比，Mdivi-1聯(lián)合ABT199能增加線粒體膜電位。提取A431細胞線粒體和胞漿蛋白分析Cyto C的表達。Western blot結果顯示Mdivi-1減弱了ABT199誘導的Cyto C從線粒體釋放至胞漿（圖6）。提取全細胞蛋白分析caspase-3和caspase-9的活化水平發(fā)現(xiàn)Mdivi-1能減弱ABT199誘導的activated caspase-3和activated caspase-9的表達上調（圖7）。

圖1 ABT199對A431細胞活力的影響

圖2 ABT199對A431細胞凋亡的影響

圖3 ABT199對線粒體長度變化的影響

圖4 ABT199對Drp-1表達的影響

圖5 ABT199對線粒體膜電位的影響

圖6 ABT199對Cyto C表達的影響

3 討 論

圖7 ABT199對activated caspase-3和activated caspase-9表達的影響

Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的失衡是腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因，同時也是標志性事件。因此，Bcl-2抗凋亡蛋白成為腫瘤治療非常重要的分子靶點。Bcl-2在皮膚鱗癌中廣泛表達，顏芹[8]報道皮膚癌中Bcl-2的表達水平與凋亡敏感性呈負相關。ABT199是Bcl-2的特異性小分子抑制劑，其可以選擇地結合到Bcl-2蛋白的疏水凹槽上，通過間接或直接的方式激活Bax/Bak，最終誘導細胞凋亡。臨床前期研究已經(jīng)表明ABT199能誘導Bcl-2高表達的腫瘤細胞凋亡，其可以顯著地誘導慢性淋巴細胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤細胞凋亡[9]。本研究結果表明ABT199能以劑量依賴性的方式抑制鱗狀皮膚癌A431細胞活力并誘導其凋亡。

在真核細胞內，線粒體不斷地發(fā)生分裂和融合，兩者一般保存著動態(tài)平衡。當兩個過程失衡時就會改變線粒體的形態(tài)，從而抑制或促進凋亡。線粒體分裂可以通過減弱線粒體網(wǎng)絡的連貫性和減少三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的產(chǎn)生抑制細胞生長。而線粒體融合能通過維持線粒體的完整性促進新陳代謝和生物能量轉換[10]。研究表明Bcl-2蛋白家族調控著線粒體動力學[11]。Drp-1是調控線粒體分裂的重要蛋白之一。在正常生理狀態(tài)下，Drp-1主要定位在胞漿內；而在分裂信號刺激下，Drp-1迅速轉位至線粒體并促進線粒體分裂。Mdivi-1是Drp-1的特異性抑制劑，它主要通過變構調節(jié)阻斷Drp-1的ATP酶活性和自組裝，從而抑制Drp-1的功能。Drp-1是線粒體分裂的標志性蛋白，一旦發(fā)生分裂，Drp-1會被Fis1和Mff招募到線粒體外膜上。EGL-1是一種新的BH3 only蛋白，其可以通過誘導Drp-1從胞漿移位至線粒體進而促進線粒體分裂[12]。同時，也有研究表明Bax和Bak的高表達能通過誘導Drp-1依賴的線粒體分裂促進細胞凋亡[11]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)Drp-1特異性抑制劑Mdivi-1能減弱ABT737誘導的線粒體分裂和Drp-1線粒體轉位，這表明了ABT199能誘導A431細胞發(fā)生Drp-1依賴的線粒體分裂。

在真核細胞內，線粒體分裂有利于線粒體膜電位下降、線粒體外膜通透性形成和促凋亡因子的釋放（如Cyto C）。線粒體分裂是位于線粒體途徑凋亡上游的一個重要生物學事件。線粒體可以通過調控caspase激活劑（如Cyto C）的釋放參與細胞凋亡過程，與此同時，線粒體發(fā)生分裂并形成顆粒狀和點狀散的線粒體。但是，目前尚不清楚線粒體分裂是線粒體途徑凋亡的原因還是結果，亦或只是一個伴隨現(xiàn)象。通過時間間隔顯微鏡，研究人員證明了Cyto C的釋放要比分裂早10 min發(fā)生，這提示了分裂可能是Cyto C釋放的一個結果[13]。但也有研究指出Drp-1介導的線粒體分裂可以導致線粒體膜電位下降和Cyto C的釋放[14]。Chae等[15]證實了Drp1K38A（Drp-1顯性失活突變體）能抑制硫代硫酸銀誘導的Cyto C釋放和凋亡。本實驗結果顯示Mdivi-1能減弱ABT199誘導的線粒體膜電位下降、Cyto C的釋放及caspase-3和caspase-9的活化。這提示了ABT199通過誘導Drp-1依賴的線粒體分裂導致了線粒體途徑的凋亡。

綜上所述，本實驗結果表明ABT199能以劑量依賴性的方式抑制A431細胞活力并誘導其凋亡。ABT199通過誘導Drp-1的線粒體轉位促進線粒體分裂，進而誘導線粒體膜電位下降，最終導致了線粒體途徑的凋亡。