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    p38 MAPK信號通路在尼古丁誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用

    2018-12-12 10:49:02王瑞玲劉雯霞劉彩紅郭蕊王亞靜
    中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新 2018年26期
    關(guān)鍵詞:自噬心血管疾病尼古丁

    王瑞玲 劉雯霞 劉彩紅 郭蕊 王亞靜

    【摘要】 目的:探討絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路在尼古丁誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)自噬中的作用。方法:不同濃度尼古?。?×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L)處理HUVECs,采用CCK-8和LDH試劑盒檢測尼古丁對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和活性的影響,運用蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測尼古丁作用下Beclin-1和LC3Ⅱ的表達及ERK1/2、JNK、p38 MAPK的磷酸化水平。

    結(jié)果:與正常對照組相比,較高濃度尼古?。ā?×10-7 mol/L)抑制HUVECs的增殖能力(P<0.01),增加上清中LDH的活性(P<0.05),且在尼古丁濃度為6×10-6 mol/L時作用最明顯。與正常對照組相比,尼古?。?×10-6 mol/L)作用下LC3Ⅱ表達顯著增加(P<0.01),而Beclin-1的表達減少(P<0.05);同時尼古丁磷酸化MAPK信號,其中ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平分別增加了0.77倍和2.91倍(P<0.01),而JNK的磷酸化水平?jīng)]有明顯變化。與尼古丁組相比,SB+尼古丁組中LC3Ⅱ與Beclin-1蛋白表達均增加(P<0.05)。結(jié)論:尼古丁可導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷并抑制細(xì)胞自噬,此過程中p38 MAPK信號通路可能起了重要作用。

    【關(guān)鍵詞】 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞; 尼古丁; 自噬; 心血管疾病; MAPK

    The Role of p38 MAPK Signaling Pathway in Nicotine-induced Vascular Endothelial Cells Autophagy/WANG Ruiling,LIU Wenxia,LIU Caihong,et al.//Medical Innovation of China,2018,15(26):0-045

    【Abstract】 Objective:To investigate the differential role of mitogen-activated protein kinase(MAPK) pathway signaling in nicotine-induced vascular endothelial cells autophagy.Method:HUVECs were treated with different doses of nicotine(6×10-9,6×10-8,6×10-7,6×10-6 mol/L) .The effect of nicotine on the proliferation and activity of vascular endothelial cells was detected by CCK-8 and LDH kit.The protein expression level of Beclin-1 and LC3Ⅱand the phosphorylation of ERK1/2、p38 and JNK induced by nicotine were detected by Western blot.Result:Compared to the control group,the results indicated that higher doses of nicotine(≥6×10-7 mol/L) inhibited the ability of cell proliferation(P<0.01),and increased the activity of supernatant LDH (P<0.05),especially the 6×10-6 mol/L of nicotine had obvious effects.Compared with normal control group,nicotine(6×10-6 mol/L) significantly increased the LC3Ⅱ protein expression(P<0.01),while decreased the protein expression of Beclin-1(P<0.05).Meanwhile,nicotine contributed to the phosphorylation of MAPK,among them,the phosphorylation of ERK1/2 and p38 MAPK increased by 0.77-fold and 2.91-fold(P<0.01),while the phosphorylation of JNK had no change.Compared to nicotine group, the LC3Ⅱand Beclin-1 protein expression of SB+nicotine group all increased(P<0.05).Conclusion:Nicotine can damage human umbilical vein endothelial cells and inhibit autophagy,and p38 MAPK signaling pathway may play an important role in this process.

    【Key words】 HUVECs; Nicotine; Autophagy; Cardiovascular disease; MAPK

    First-authors address:Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.010

    心血管疾病死亡率居全球之首,而吸煙與心血管疾病有密切聯(lián)系[1]。香煙的主要成分尼古丁,可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、炎癥、血管再生及凋亡,從而引起血管內(nèi)皮功能紊亂[2]。但是,尼古丁引起血管內(nèi)皮功能紊亂的確切機制還有待進一步研究。自噬是真核生物中進化保守,降解多余、衰老或受損胞內(nèi)物質(zhì)的過程[3]。正常情況下很少發(fā)生自噬,但當(dāng)缺血缺氧、代謝壓力、蛋白質(zhì)折疊錯誤等情況下可誘發(fā)自噬[4-6]。此外,自噬生成或降解受阻時可導(dǎo)致細(xì)胞功能異常甚至受損及死亡[7]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi)的重要傳遞者,目前有大量研究認(rèn)為MAPK信號家族在自噬各階段有重要作用[8-11]。據(jù)此,本實驗旨在研究尼古丁對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性和自噬的影響,探討該過程中MAPK信號家族所起的重要作用,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)(中喬新舟,上海);DMEM低糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、PBS緩沖液、青鏈霉素、Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒、β-actin抗體(博士德生物,武漢);胎牛血清(浙江天杭生物,杭州);乳酸酶脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物,南京);尼古丁(Sigma,美國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物,上海);LC3B(Sigma,美國);Beclin-1、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、ERK1/2、p38、JNK抗體(CST,美國),辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(中杉金橋生物,北京);ECL發(fā)光液(愛必信生物,上海)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs,置于5%CO2、37 ℃

    孵箱,待細(xì)胞融合至80%進行不同濃度尼古丁(6×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L)處理24 h,6×10-6 mol/L尼古丁處理1 h或6 h,其中正常對照組不做尼古丁處理。每組處理樣本數(shù)為n=3,所有實驗均獨立重復(fù)3次。

    1.2.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 將HUVECs接種于96孔板,密度為1×105/mL,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的尼古丁。按照Cell Counting Kit-8檢測試劑盒說明書進行操作,孵育完成后用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各孔OD值。

    1.2.3 LDH試劑盒檢測細(xì)胞活性 將HUVECs以1×106/mL密度接種于6孔板,待細(xì)胞融合至80%,用不同濃度尼古丁處理后分別收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞。按照乳酸脫氫酶測定試劑盒說明書進行操作,之后用酶標(biāo)儀在450 nm處測定各樣本的OD值,并根據(jù)公式計算各組上清中LDH的活力。

    1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板,融合至80%時分為兩組:正常對照組和尼古丁組(6×10-6mol/L)(根據(jù)尼古丁對細(xì)胞增殖能力和活性影響,確定的實驗?zāi)峁哦〗K濃度),分別給予不同處理后提取細(xì)胞總蛋白。提取細(xì)胞總蛋白具體方法:棄培養(yǎng)上清后置于冰上,預(yù)冷PBS沖洗3次,加入配置好的細(xì)胞裂解液,待細(xì)胞裂解后收集于離心管超聲破碎及低溫離心,離心完畢后抽取上清并用BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度,根據(jù)上樣量制備蛋白樣本。95 ℃,5 min蛋白變性,制備12%SDS-PAGE凝膠進行電泳分離蛋白質(zhì),電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。待封閉完成,TBST洗膜3次,每次5 min。將膜置于蛋白相對應(yīng)的一抗稀釋液(1︰1 000)孵育,4 ℃過夜。TBST洗膜

    3次后,與一抗同源的二抗室溫?fù)u床孵育1 h。洗膜后即可用ECL發(fā)光液進行壓片顯影。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPPP 18.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析處理,計量資料采用(x±s)表示。兩組間比較使用t檢驗,多組間比較則采用單因素方差分析(one-Way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度尼古丁對HUVECs增殖能力的影響 不同濃度尼古丁處理HUVECs 24 h,尼古丁濃度≤6×10-8 mol/L時,細(xì)胞的增殖能力為(92.08±3.89)、(91.05±4.24),與正常對照組(99.00±0.87)比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.292、0.121);當(dāng)尼古丁濃度≥6×10-7 mol/L

    時,細(xì)胞的增殖能力減弱,分別為(65.35±6.68)、(61.26±1.98),與正常對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 0、0.000 0),且呈尼古丁劑量抑制依賴性關(guān)系,見圖1。

    2.2 不同濃度尼古丁對HUVECs中LDH活力的影響 不同濃度尼古丁處理HUVECs 24 h,尼古丁濃度≤6×10-8 mol/L時,上清中LDH活力分別為(9.92±1.52)、(10.51±1.10),與正常對照組(8.82±0.83)相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.207、0.082);當(dāng)尼古丁濃度≥6×10-7 mol/L時,上清中LDH活力呈尼古丁濃度依賴性增加,分別為(13.70±1.20)、(15.50±0.71),與正常對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 0、0.000 0),見圖2。

    2.3 尼古丁抑制HUVECs自噬 濃度為6×10-6 mol/L的尼古丁干預(yù)細(xì)胞6 h,與正常對照組相比,尼古丁組LC3Ⅱ蛋白表達增加了1.41倍(1.33±0.12 vs 0.47±0.12,t=8.489,P=0.001),而此時Beclin-1蛋白表達卻減少了0.73倍(0.19±0.06 vs 0.33±0.02,t=4.013,P=0.016),見圖3。

    2.4 尼古丁誘導(dǎo)MAPK磷酸化 與正常對照組相比,尼古丁處理1 h后MAPK信號家族成員中,ERK1/2、p38磷酸化水平均增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而JNK的磷酸化水平并無明顯變化。其中,尼古丁組ERK1/2磷酸化水平(1.63±0.08)與對照組(0.92±0.11)相比增加了0.77倍(t=8.828,P=0.0009);而尼古丁組p38 MAPK的磷酸化水平(2.42±0.16)與對照組(0.62±0.11)相比增加了2.91倍(t=17.96,P=0.000 1)。見圖4。

    2.5 p38 MAPK抑制自噬的生成 p38 MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理HUVECs 30 min后給予尼古丁處理6 h。與尼古丁組LC3Ⅱ蛋白表達(1.33±0.12)相比,SB+尼古丁組LC3Ⅱ蛋白表達進一步增加(1.65±0.10)(P=0.014);與尼古丁組Beclin-1蛋白表達(0.11±0.03)相比,SB+尼古丁組的Beclin-1蛋白表達也進一步增加(0.27±0.01)(P=0.007)。見圖5。

    3 討論

    吸煙是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。香煙的主要成分尼古丁可以促進心血管疾病發(fā)生[12-14]。尼古丁通過多種機制增加炎癥因子釋放、黏附分子的表達,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂[15];此外尼古丁還可以通過激活肥大細(xì)胞促進動脈粥樣硬化疾病的進展[16],但是確切機制還不清楚。本實驗旨在通過離體實驗用尼古丁干預(yù)正常HUVECs,證實尼古丁作用下HUVECs增殖能力減弱且細(xì)胞膜受損,同時細(xì)胞自噬的生成受到抑制,而在該過程中p38 MAPK信號具有重要作用。

    心血管疾病是由吸煙、高血壓等多種因素引起的一系列繼發(fā)性缺血性改變,而尼古丁可通過紊亂內(nèi)皮細(xì)胞功能從而促進心血管疾病的發(fā)展[17]。已有多項研究表明,尼古丁可促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活及增加細(xì)胞自噬[18],而還有研究認(rèn)為尼古丁對內(nèi)皮細(xì)胞有毒性作用從而促進細(xì)胞死亡[19]。這些爭議存在的原因可能是由于實驗所用尼古丁濃度不同導(dǎo)致的。據(jù)此,本實驗采用不同濃度的尼古?。?×10-9、6×10-8、6×10-7、6×10-6 mol/L)處理HUVECs,檢測尼古丁作用下細(xì)胞的增殖能力與損傷程度,以確定實驗所用尼古丁終濃度。本研究發(fā)現(xiàn),6×10-9、6×10-8 mol/L尼古丁濃度組內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力和培養(yǎng)上清LDH活性與正常對照組相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而尼古丁濃度為6×10-7、6×10-6 mol/L時兩個指標(biāo)都發(fā)生了明顯變化,且呈尼古丁濃度依賴性。這提示較高濃度的尼古丁可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,破壞細(xì)胞膜的完整性,促進細(xì)胞損傷。之前有報道發(fā)現(xiàn)尼古丁濃度低于

    10-8 mol/L時可促進細(xì)胞增殖和存活,而高濃度尼古丁(>10-6 mol/L)則對內(nèi)皮細(xì)胞有損傷和毒性作用[20],這與本實驗研究結(jié)果相一致。因此,為了研究尼古丁對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制和損傷的機制,選用高濃度尼古?。?×10-6 mol/L)做進一步研究。

    自噬(大自噬)過程主要包括自噬的生成和降解兩個階段:即自噬小體的形成與自噬小體和溶酶體融合降解。Beclin-1是哺乳動物誘導(dǎo)自噬生成起始的基因,微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)則是自噬小體標(biāo)志物。本實驗中,尼古丁作用下Beclin-1蛋白表達減少,提示尼古丁作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬生成水平下降;而LC3Ⅱ表達增多,這與自噬生成減少相矛盾,提示尼古丁還可能影響自噬的降解過程。

    絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)主要分為3個亞族:ERK1/2、JNK、p38 MAPK通路是多種信號通路的中心,參與細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、凋亡等多種生理反應(yīng)過程[21]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn),MAPK信號家族在自噬的調(diào)控過程中有重要作用[8-11],比如不同細(xì)胞類型和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件下,p38 MAPK對自噬有促進或抑制作用[11,22]。本實驗中,尼古丁作用下并沒有發(fā)現(xiàn)JNK的磷酸化,而ERK1/2和p38 MAPK磷酸化增多,且p38 MAPK磷酸化水平增加更顯著。使用p38 MAPK抑制劑SB203580后可逆轉(zhuǎn)尼古丁作用下Beclin-1蛋白表達的減少,而此時LC3Ⅱ可能由于Beclin-1生成增多而增加。這提示MAPK家族成員p38 MAPK在尼古丁引起的自噬生成抑制環(huán)節(jié)中起重要作用,但是可能并不直接參與自噬的降解過程。此外,自噬的生成是否還與其他信號通路有關(guān),以及自噬小體標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ蛋白增多的原因還有待進一步探究。

    綜上所述,本實驗初步研究了尼古丁對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活性及自噬的影響,且探討了MAPK在該過程中的作用,揭示了p38 MAPK在尼古丁引起的自噬生成抑制中有重要作用,而自噬生成抑制可能是細(xì)胞受損的原因之一。總之,本研究從機制方面為尼古丁引起的心血管疾病的治療提供了新思路。

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    (收稿日期:2018-03-26) (本文編輯:張爽)

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