有機(jī)溶劑萃取高效液相色譜法檢測(cè)玉米漿中黃曲霉毒素B1

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(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是一類以黃曲霉和寄生曲霉為代表的霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,人類通過(guò)玉米、堅(jiān)果或牛奶等食品可能攝入不定量的黃曲霉毒素,而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良、免疫抑制和肝細(xì)胞癌變等癥狀。在18種黃曲霉毒素中,黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)的毒性最強(qiáng),且廣泛存在于各類糧食和經(jīng)濟(jì)作物中,所以AFB1被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)列為毒物之首,2002年被國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為Ⅰ級(jí)強(qiáng)致癌物[1-3]。

玉米漿是利用濕法工藝生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)物,其含有可溶性蛋白、游離脂肪酸、可溶性糖類和維生素等多中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。玉米漿是微生物和動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)原料,被廣泛用作優(yōu)質(zhì)氮源添加到微生物的培養(yǎng)基中[4],或作為蛋白質(zhì)來(lái)源直接添加到動(dòng)物飼料中[5]。玉米漿中的毒素來(lái)源主要是原材料玉米,另外由于玉米漿的生產(chǎn)工藝耗時(shí)長(zhǎng),其過(guò)程中可能產(chǎn)生霉變,也能導(dǎo)致霉菌毒素的產(chǎn)生,最后影響所得到產(chǎn)品的安全性[6-7]。根據(jù)我國(guó)GB 2761-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定，玉米及其制品中AFB1限量標(biāo)準(zhǔn)為20 μg/kg,而且在飼料中的限量標(biāo)準(zhǔn)低于10 μg/kg[8]。目前,在我國(guó)的飲食、飼料等加工產(chǎn)品中,AFB1的存在是個(gè)亟待解決的問(wèn)題[9-10],所以針對(duì)于原料中的AFB1的檢測(cè),需要一個(gè)簡(jiǎn)單有效的方法。

目前有很多檢測(cè)AFB1的方法,主要有薄層層析法(TLC)[11]、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[12-13]、酶聯(lián)免疫吸附層析法(ELISA)[14-15]、高效液相色譜法(HPLC)[16],其中HPLC具有檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確的特點(diǎn),受權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可。在我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)AFB1檢測(cè)方法主要有HPLC法。但是國(guó)標(biāo)法中柱前衍生容易導(dǎo)致檢測(cè)的重復(fù)性差,導(dǎo)致結(jié)果缺乏可信度,而且操作復(fù)雜,容易受樣品中其他物質(zhì)的干擾。

因此本文通過(guò)簡(jiǎn)單預(yù)提取凈化方法,利用不同的有機(jī)溶劑萃取AFB1,并分析了溫度、流動(dòng)相等各種影響因素[17-18],選擇合適的高效液相色譜條件利用簡(jiǎn)單的紫外檢測(cè)即可檢測(cè)AFB1,建立了簡(jiǎn)單、廉價(jià)的檢測(cè)玉米漿中黃曲霉毒素B1的方法,為食品安全提供進(jìn)一步的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米漿(包括玉米漿濕樣和干樣) 收集山東濰坊盛泰藥業(yè)有限公司;黃曲霉毒素標(biāo)品 以色列Fermentek公司;甲醇、乙腈 Sigma;二氯甲烷 國(guó)藥集團(tuán)科技有限公司;氯仿 國(guó)藥集團(tuán)科技有限公司。

LC-20AD高效液相色譜儀(配SPD-20A紫外檢測(cè)器) 日本Shimadzu公司;真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BILON-6000Y噴霧干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司;恒溫電磁攪拌水浴鍋 河南予華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米漿中毒素的提取與凈化 稱取玉米漿干樣和濕樣各20 g分別置于100 mL三角瓶,再加入20 mL有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈、二氯甲烷、氯仿)萃取,利用磁力攪拌器100 r/min攪拌20 min,25 ℃,9000 r/min離心5 min,吸取離心管最下層有機(jī)溶液,重復(fù)上述萃取步驟2次,并將收集的有機(jī)層溶液溶液集中于一管。將萃取收集的溶液至于真空干燥箱,45 ℃真空干燥2 h,干燥后加入1 mL甲醇得到AFB1甲醇溶液,-20 ℃保存待檢測(cè)。

1.2.2 色譜條件 高效液相色譜儀:LC-20AD;紫外檢測(cè)器:SPD-20A;色譜柱:C18Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm);初始流速:0.7 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng):365 nm;初始流動(dòng)相∶甲醇/水=50∶50。初始柱溫:25 ℃。

1.2.3 萃取劑的篩選 取空白玉米漿干粉樣按1 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo),分別用甲醇、乙腈、二氯甲烷和氯仿4種有機(jī)溶劑按1.2.1方法萃取,按1.2.2 HPLC條件檢測(cè),計(jì)算標(biāo)樣萃取后的回收率。

1.2.4 色譜條件的優(yōu)化 流動(dòng)相優(yōu)化:柱溫25 ℃,流速0.7 mL/min,先用了甲醇/水(50∶50)、乙腈/水(50∶50)體系,在甲醇/水(50∶50)的基礎(chǔ)上,甲醇占比不變的條件下,加入5%乙腈代替5%水,以5%為梯度逐步增加乙腈的占比至甲醇/乙腈(50∶50)，觀察AFB1峰型及出峰時(shí)間。柱溫優(yōu)化:在流動(dòng)相甲醇/乙腈/水(50∶30∶20)、流速0.7 mL/min條件下,在25、30、35 ℃柱溫條件下，觀察AFB1峰型及出峰時(shí)間。流速:在優(yōu)化的流動(dòng)相甲醇/乙腈/水(50∶30∶20),柱溫30 ℃條件下,在流速為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min觀察AFB1峰型及出峰時(shí)間。所檢測(cè)的AFB1來(lái)源于混有1 μg/mL AFB1標(biāo)樣的空白玉米漿中的AFB1峰型和出峰時(shí)間。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液,HPLC檢測(cè),以AFB1濃度為橫坐標(biāo),峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 對(duì)照試驗(yàn) 用本研究的方法和GB/T 5009. 22-2016檢測(cè)5個(gè)不同批次干樣和濕樣中的AFB1,每個(gè)批次5個(gè)平行,取平均值作為對(duì)應(yīng)批次檢測(cè)的AFB1含量[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用Croeldraw X4.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取劑選擇

4種有機(jī)溶劑萃取后的AFB1回收率如表1所示,可以發(fā)現(xiàn)4種有機(jī)溶劑萃取標(biāo)樣的回收率都很高,同時(shí)根據(jù)4種萃取后所呈現(xiàn)的色譜圖(圖1)分析,由甲醇和乙腈所萃取的樣品的雜質(zhì)含量較高,可能因?yàn)橛衅渌恍┢苄晕镔|(zhì)同樣溶于甲醇和乙腈,而不溶于二氯甲烷和氯仿這些極性相對(duì)較弱的有機(jī)試劑。為了減少檢測(cè)中雜質(zhì)的干擾,同時(shí)考慮到有機(jī)溶劑的安全性(氯仿相對(duì)于二氯甲烷更不穩(wěn)定,毒性更大),二氯甲烷的沸點(diǎn)較氯仿要低,更易揮發(fā),選用二氯甲烷做萃取劑。

圖1 不同有機(jī)溶劑萃取玉米漿中標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard sample extracted from corn syrup by different organic solvents注:A:甲醇;B:乙腈;C:二氯甲烷;D:氯仿。

圖2 不同流動(dòng)相組成呈現(xiàn)的AFB1色譜圖Fig.2 Chromatogram of AFB1 presented by different mobile phases注:A:甲醇/水=50∶50;B:乙腈/水=50∶50;C:甲醇∶乙腈∶水=50∶30∶20。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相 目前,AFB1檢測(cè)用的常用流動(dòng)相組合會(huì)因?yàn)閮x器、樣品等其他條件而異,常用的有機(jī)溶劑主要包括甲醇、乙腈、異丙醇、三氯甲烷。根據(jù)GB/T 5009.22-2016規(guī)定流動(dòng)相為水、乙腈和甲醇，并采用等梯度洗脫,但是在檢測(cè)過(guò)程中，基線容易發(fā)生偏移，導(dǎo)致定量的準(zhǔn)確性下降。

本文首先考慮等梯度洗脫,分別應(yīng)用了甲醇/水(50∶50)、乙腈/水(50∶50)體系,乙腈/水體系出峰慢,響應(yīng)相對(duì)較差,而甲醇/水體系的洗脫效果欠佳,所以當(dāng)甲醇/乙腈/水形成三元混合流動(dòng)相有了更好的分離效果,且響應(yīng)效果好。以空白玉米漿為樣品按1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)加入AFB1標(biāo)樣,其他條件不變的情況下進(jìn)行了流動(dòng)相配比優(yōu)化,并最終確定了以甲醇/乙腈/水(50∶30∶20)為流動(dòng)相。經(jīng)過(guò)此流動(dòng)相的洗脫,AFB1峰基本可以和雜峰分離開(kāi)(圖2)。

2.2.2 柱溫 在一定情況下,柱溫會(huì)影響到分離效率,也可能改變檢測(cè)物質(zhì)的成分。因此,在其他的色譜條件不變的前提下，比較了25、30、35 ℃柱溫下的色譜圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30 ℃時(shí)呈現(xiàn)峰型較好,分離度高,且沒(méi)有多的雜峰,而當(dāng)溫度過(guò)低，出峰時(shí)間過(guò)晚,溫度過(guò)高，雜峰數(shù)明顯增多,影響檢測(cè)定量的準(zhǔn)確性(圖3)。

2.2.3 流速 在其他條件不變的前提下，比較了流速0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min時(shí)樣品所呈現(xiàn)的色譜圖的峰,結(jié)果如圖4,在流速為0.7 mL/min時(shí),出峰時(shí)間相對(duì)適宜,且分離效果比較理想。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

如前所述,分別配制0. 4、0. 8、1.2、1.6、2.0 μg/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,在所優(yōu)化的色譜條件下測(cè)定,用峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,AFB1的質(zhì)量濃度在0.4～2.0 μg/mL的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y=83564x+1648,相關(guān)系數(shù)r為0. 9988,其線性范圍0.4～2.0 μg/mL。

2.4 樣品檢測(cè)的回收率和精密度

用上述方法分別提取濕玉米漿和玉米漿干粉按表所示量添加AFB1,然后進(jìn)行萃取凈化、HPLC檢測(cè),每個(gè)樣品3個(gè)平行,重復(fù)5次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),根據(jù)表中數(shù)據(jù)可證明本方法檢測(cè)玉米漿中的黃曲霉毒素B1具有可行性。

圖3 不同柱溫下呈現(xiàn)的AFB1色譜圖Fig.3 Chromatogram of AFB1 presented by different column temperatures注:A:25 ℃;B:30 ℃;C:35 ℃。

圖4 不同流速下呈現(xiàn)的AFB1色譜圖Fig.4 Chromatogram of AFB1 presented by different flow rates注:A:0.5 mL/min;B:0.6 mL/min;C:0.7 mL/min;D：0.8 mL/min;E：0.9 mL/min;F：1.0 mL/min。

表2 檢測(cè)樣品的回收率和精確度Table 2 Recovery and precision of the tested samples

2.5 對(duì)照實(shí)驗(yàn)

選取污染的玉米漿5個(gè)批次濕樣和干樣,根據(jù)GB/T 5009. 22-2016所規(guī)定的樣品提取凈化方法和本實(shí)驗(yàn)的提取凈化方法,然后進(jìn)行HPLC檢測(cè),所得結(jié)果如表3所示。對(duì)兩種方法進(jìn)行線性回歸分析的回歸方程:y=0.9878x+0.123,R2=0.9949,經(jīng)過(guò)t檢驗(yàn)(p>0.05)和F檢驗(yàn)(F=0.002

目前,還沒(méi)有對(duì)玉米漿中AFB1的檢測(cè)及去毒方法的明確報(bào)道。在AFB1的提取和凈化方面,本方法沒(méi)有通過(guò)制作凈化柱來(lái)提取并凈化樣品中的AFB1,而用有機(jī)溶劑萃取凈化，更為便捷。在檢測(cè)方面,本方法和國(guó)標(biāo)法相比,省去了復(fù)雜的衍生步驟,而且設(shè)備成本更加低廉,得到的結(jié)果具有準(zhǔn)確性、可靠性。

3 結(jié)論

表3 本方法與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)玉米漿的結(jié)果對(duì)比Table 3 Comparison of the results of testing corn syrup by this method and the national standard method

圖5 AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of AFB1

注:p=0.9609>0.05,F=0.0025

本文優(yōu)化了一種檢測(cè)玉米漿中黃曲霉毒素B1的方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異(p>0.05),該方法更簡(jiǎn)單、廉價(jià),安全性好,適用于玉米漿中AFB1的檢測(cè),有助于對(duì)玉米制品、飼料等制品的質(zhì)量安全的有效控制。該方法同樣還可以適用于一些非油類食品或者食品原料(玉米粉、豆粕粉等)中的AFB1檢測(cè),但不適用于一些油類物質(zhì)中的毒素檢測(cè),油類物質(zhì)可能會(huì)影響到AFB1的萃取效率,也可能會(huì)有一些易溶于有機(jī)溶劑的其他天然化合物對(duì)AFB1的檢測(cè)產(chǎn)生干擾,針對(duì)不同類型的樣品,需要找到對(duì)應(yīng)的適宜的處理方法[20],才能更快、更精確地保障一些產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題。