鈰摻量對(duì)羥基磷灰石結(jié)構(gòu)及吸附性能的影響

殷海榮，張 森，白建光，王翠翠，王 飛，陳 平，汪楓帆

(陜西科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

隨著時(shí)代的發(fā)展和醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的綠色生物材料被用于臨床試驗(yàn).羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2，Hydroxyapatite，HAp]作為脊椎動(dòng)物礦物組織中的重要組成，受到越來越多研究者的青睞.據(jù)調(diào)查，HAp約占其骨骼和牙齒無機(jī)物含量的60%，具有良好的生物相容性和生物活性[1].HAp能吸附葡萄糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等，所以還被用于牙膏添加劑，有利于牙周炎的防治.HAp良好的生物活性使其能與骨質(zhì)、牙齒完美的結(jié)合，植入人體后能在界面上和骨形成很強(qiáng)的化學(xué)性鍵合，能誘導(dǎo)和促進(jìn)骨組織生長(zhǎng)；在穿皮器械和軟組織的功能恢復(fù)治療中HAp也有一定的應(yīng)用，HAp材料已廣泛地應(yīng)用于臨床領(lǐng)域[2,3].

相比天然的HAp，人工合成的HAp納米顆粒不僅具有良好的促進(jìn)成骨分化的效應(yīng)，還可以作為藥物載體，既可以單獨(dú)用于藥物負(fù)載，也可以和CS、PLGA等高分子制成復(fù)合藥物控釋/緩釋體系[4,5].人工合成的納米HAp材料克服了傳統(tǒng)HAp材料脆性大、難降解等的缺點(diǎn)，能夠顯著提高其生物相容性和生物活性，具有促進(jìn)新生骨的生成并且不發(fā)生免疫排斥的作用.

由于HAp具有良好的離子交換性能[6,7]，故近些年來，關(guān)于離子摻雜HAp的研究越來越多，如ZnHAp、MgHAp、EuHAp、AgHAp等.合成的離子摻雜型HAp拓寬了其在生物醫(yī)學(xué)、牙科和凈化系統(tǒng)等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用.不同離子摻雜HAp能夠賦予其不同的性質(zhì).例如，A.Bootchanont等[8]研究了溶膠-凝膠法合成Sr-HA材料，發(fā)現(xiàn)Sr替代HAp中Ca1位置，靠近能與活骨組織結(jié)合的磷酸基團(tuán)(-PO4)；Stipniece L等[9]通過噴霧干燥法合成了Mg取代的HAp生物陶瓷微球，并研究了蛋白質(zhì)在MgHAp生物陶瓷微球上的吸附能力.

鈰(Ce)是一種具有抗齲性能的稀土元素，Ce的生物醫(yī)學(xué)性能早已被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于各種臨床條件.此外，人體骨骼中的少量Ce離子可以加速生物體的新陳代謝[10,11].鈰有較強(qiáng)抑制變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的作用，也用于抗菌劑[12].鈰局部應(yīng)用時(shí)可置換牙齒HAp中的鈣，并在牙面吸附，形成膜狀沉積物，提高牙齒的抗酸蝕能力.Kanchana P等[13]以CeHA和玻璃碳電極為原料，制備了一種新型生物傳感器；Yuan Q等[11]使用CeHAp與聚乳酸制備了復(fù)合涂層，研究了Ce在HAp及其復(fù)合涂層的存在形式；黃勇等[14]用微弧氧化法在純鈦金屬表面原位生成了多孔含Ce羥基磷灰石生物涂層.并對(duì)膜層的厚度、物相、成分組成及生物相容性進(jìn)行了研究；Priyadarshini B等[15]通過溶膠-凝膠回流技術(shù)合成了鈰(Ce4+)摻雜的羥基磷灰石(CeHAp)，并進(jìn)行了體外生物學(xué)研究，如血液相容性、抗菌活性和生物相容性等.

本文以化學(xué)沉淀法制備了不同摻鈰比的羥基磷灰石材料，研究了鈰摻量對(duì)羥基磷灰石結(jié)構(gòu)和性能的影響.以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，考察了CeHAp對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能，以期找到更好的生物載體材料.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

四水硝酸鈣[Ca(NO3)2·4H2O)](純度≥99%)，六水硝酸鈰[Ce(NO3)3·6H2O](純度≥99%)，六水硝酸鎂[Mg(NO3)2·6H2O](純度≥99%)，磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4](純度≥99%)，氫氧化鈉(NaOH)(純度≥96%)，牛血清白蛋白(BSA)(純度≥98%)和1 M磷酸鹽緩沖液(PBS).實(shí)驗(yàn)中所用的水為超純水，所有化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司.

1.2 CeHAp的制備

采用化學(xué)沉淀法制備不同鈰摻比的羥基磷灰石材料，分別配制0.1 mol·L-1Ca(NO3)2·4H2O溶液，0.1 mol·L-1Ce(NO3)3·6H2O溶液，0.1 mol·L-1(NH4)2HPO4溶液，2 mol·L-1的NaOH溶液.將一定體積的0.1 mol·L-1的Ca(NO3)2·4H2O溶液和0.1 mol·L-1Ce(NO3)3·6H2O溶液充分混合均勻，其中控制Ce/(Ce+Ca) 的物質(zhì)的量分別為0 mol%、2 mol%、4 mol%、6 mol%、8 mol%、10 mol%.向混合溶液中緩慢逐滴滴加0.1 mol·L-1(NH4)2HPO4溶液，調(diào)節(jié)溶液中的(Ce+Ca)/P的物質(zhì)的量之比為1.67，使用磁力攪拌器持續(xù)攪拌混合溶液；用2 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH值到12，直到該混合溶液的pH值在半個(gè)小時(shí)之內(nèi)不會(huì)有比較大的變動(dòng)，繼續(xù)攪拌4個(gè)小時(shí).攪拌結(jié)束后再在80 ℃條件下陳化24小時(shí)，陳化結(jié)束后進(jìn)行洗滌(10次以上)、抽濾、干燥，然后研磨即得到不同鈰摻比的羥基磷灰石樣品.其中，Ce/(Ce+Ca)=2 mol%的CeHAp記為Ce0.02HAp，其他都依此標(biāo)記.反應(yīng)方程式如下：

(10-X)Ca2++XCe3+/4++6PO43++2OH-→

Ca10-xCex(PO4)6(OH)2

(1)

1.3 主要表征方法

使用X射線衍射儀(XRD，D/MAX2200PC，日本)對(duì)CeHAp進(jìn)行物相分析.使用傅立葉紅外光譜儀(FTIR，Bruker VECTOR-22)在400～4 000 cm-1的掃描范圍下分析樣品的表面官能團(tuán).使用高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM,JEOL-JEM2010,日本)對(duì)樣品進(jìn)行形貌分析.使用XPS分析樣品的化學(xué)組成及元素結(jié)合狀態(tài).通過N2吸附脫附等溫線來獲得比表面積.孔徑分布由Barrett- Joiner- Halenda(BJH)方法根據(jù)等溫線的脫附曲線獲得.使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量吸光度.

1.4 蛋白吸附實(shí)驗(yàn)

1.4.1 牛血清蛋白(BSA)吸附標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別配制濃度為0.1 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.7 mg·mL-1、0.9 mg·mL-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)液在280 nm處的吸光度A值，BSA的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A值為縱坐標(biāo)，繪制BSA濃度-A標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示.

圖1 BSA濃度-A標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.2 CeHAp樣品蛋白吸附量的測(cè)定

將40 mg CeHAp加入20 mL濃度為0.5 mg·mL-1的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液中，充分混合后，放入37 ℃恒溫?fù)u床，振蕩2 h，進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)，振蕩結(jié)束的混懸液在離心機(jī)上以轉(zhuǎn)速為3 000 r/min離心10 min，使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量上清液的吸光度A值，根據(jù)上述BSA濃度-A標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得上清液的濃度C上清.所有吸附實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值.由下述公式計(jì)算BSA的吸附量Q:

Q=(C標(biāo)準(zhǔn)-C上清)V/W

(2)

式(2)中：Q-BSA的吸附量(mg·g-1)；C標(biāo)準(zhǔn)-BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，(mg·mL-1)；C上清-上清液的濃度(mg·mL-1)；V-加入的BSA的體積(mL)；W-吸附材料的質(zhì)量(g).

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)及形貌分析

圖2是不同鈰摻量羥基磷灰石樣品的XRD圖.從圖2可以看出，CeHAp主要衍射峰和HAp(JCPDS 09-432)完全一致，沒有β-TCP或者氧化鈰等次生相的生成，說明制備的鈰摻羥基磷灰石具有較高的純度[15]；隨著鈰摻量的增加，主要衍射峰強(qiáng)度減弱，衍射峰變寬，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因是Ce3+的半徑(0.102 nm)大于Ca2+的半徑(0.099 nm)，從而當(dāng)Ce3+取代替換Ca2+后，Ce3+取代羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)中Ca2+的位置，致使衍射峰弱化和擴(kuò)大，樣品的結(jié)晶性下降[13].

圖2 HAp和CeHAp樣品的XRD圖譜

圖3顯示了HAp和CeHAp樣品的FTIR圖譜.從圖3觀察到，不同鈰濃度的摻雜羥基磷灰石試樣的特征峰大致相同，與純羥基磷灰石試樣的特征峰一致.對(duì)于羥基磷灰石的特征峰在六個(gè)譜圖中都有顯示，其中，位于1 098 cm-1和1 036 cm-1處的吸收峰是屬于P-O鍵的ν3伸縮振動(dòng)吸收峰，位于962 cm-1處的吸收峰是屬于P-O鍵的ν1伸縮振動(dòng)吸收峰，而位于468 cm-1、566 cm-1以及604 cm-1處的吸收峰則是屬于PO43-離子中O-P-O鍵的ν4伸縮振動(dòng)峰[14,16]；3 569 cm-1是-OH的特征振動(dòng)峰，分子水和吸附水也在1 645 cm-1處出現(xiàn)；在1 468 cm-1和1 419 cm-1處是碳酸根基團(tuán)的振動(dòng)峰.結(jié)果表明，鈰摻雜對(duì)羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)無顯著的影響，該結(jié)果與XRD結(jié)果一致.

圖3 HAp和CeHAp樣品的FTIR圖譜

圖4顯示了HAp和CeHAp樣品的TEM圖像以及HRTEM結(jié)果.圖4(a)中HAp的顯微照片顯示了具有棒狀形態(tài)的顆粒.由圖4可知，隨著Ce含量的增加，發(fā)現(xiàn)顆粒尺寸逐漸減小.摻雜顆粒表現(xiàn)出較高的聚集趨勢(shì)，這種趨勢(shì)隨著摻雜劑含量的增加而增加.這種影響可歸因于較大的表面積與體積比，當(dāng)兩個(gè)顆粒相互碰撞時(shí)，如果它們之間的吸引力大于顆粒耗散的慣性力，就會(huì)形成團(tuán)聚體[17].HRTEM圖像可以進(jìn)一步觀察到排列良好的晶格條紋.HAp的晶面間距約為3.343 5 ?，屬于(002)晶面.Ce0.04HAp中晶面間距為2.815 3 ?屬于(211)晶面，Ce0.08HAp中晶面間距為2.730 8 ?屬于(300)晶面，d002、d211和d300與文獻(xiàn)值相符(JCPDS#09-432;d002=3.440 0 ?，d211=2.814 0 ?，d300=2.720 0 ?)，晶面間距隨Ce含量的增加而略有增加.

(a)HAp樣品的TEM及HRTEM圖像

(b)Ce0.04HAp樣品的TEM及HRTEM圖像

(c)Ce0.08HAp樣品的TEM及HRTEM圖像圖4 HAp和CeHAp的TEM及HRTEM圖像

圖5(a)顯示了0～1 200 eV結(jié)合能范圍內(nèi)Ce0.06HAp樣品的XPS譜，Ce0.06HAp樣品的擬合Ce 3d高分辨XPS峰在圖5(b)中.

從圖5(a)可以看出，Ca(2p，346 eV)、P(2p，131 eV)、O(1s，530 eV)和Ce 3d區(qū)域，870～920 eV被檢測(cè)到，C被用作參考.位于131 eV的P 2p核心能級(jí)峰是由于PO43-中的P-O鍵產(chǎn)生的；從圖5(b)可知，結(jié)合能的值與Ce3+(3d5/2=896.47 eV，885.17 eV和3d3/2=880.87 eV，899.51 eV，904.87 eV)和Ce4+(3d5/2=882.86 eV和3d3/2=915.36 eV)一致[18,19].所有CeHAp樣品顯示相似的XPS光譜.這些XPS結(jié)果表明在CeHAp樣品中存在Ce的混合價(jià)態(tài)(Ce3+和Ce4+)，并且證明了在HAp晶格中成功摻雜了Ce離子.

(a)Ce0.06HAp樣品的XPS總圖譜

(b)擬合Ce3d高分辨XPS峰圖5 Ce0.06HAp樣品的XPS圖譜

2.2 比表面積及孔徑分布分析

通過將Brunauer-Emmett-Teller(BET)方程擬合到N2吸附等溫線來確定CeHAp樣品的表面性質(zhì).圖6顯示了HAp和Ce0.06HAp的氮吸附等溫線和孔徑分布(插圖).樣品的結(jié)構(gòu)參數(shù)如表1所示.

從數(shù)據(jù)可以看出，隨著Ce濃度的增加，樣品的比表面積逐漸增加，平均孔徑逐漸減小.根據(jù)IUPAC分類，所有CeHAp樣品顯示類似的IV等溫線和典型的H1-回滯環(huán)，表明CeHAp樣品具有介孔材料的典型性質(zhì).BJH孔徑分布表明中孔的存在(孔徑在2 nm至20 nm之間)[20].因此，Ce離子的摻雜增加了羥基磷灰石的比表面積，并沒有改變介孔羥基磷灰石的基本孔結(jié)構(gòu).在一定程度上，比表面積的增加可以改善吸附性能.

(a)HAp的N2吸附等溫線和孔徑分布

(b)Ce0.06HAp的N2吸附等溫線和孔徑分布圖6 樣品的N2吸附等溫線和孔徑分布

表1 HAp和CeHAp樣品的表面性能數(shù)據(jù)

2.3 牛血清白蛋白吸附分析

圖7是HAp和CeHAp樣品的BSA吸附圖.由圖7可知，樣品的吸附容量隨著鈰摻雜量的增加而增加.HAp和蛋白質(zhì)分子之間有兩種類型的吸附：通過HAp多孔結(jié)構(gòu)表面弱物理吸附和HAp與BSA之間的強(qiáng)靜電相互作用吸附[21].由于樣品的尺寸逐漸變小，比表面積逐漸增加，因此在顆粒之間形成了積聚的孔隙，CeHAp的活性吸附位點(diǎn)更多地暴露出來，由于物理吸附，樣品的吸附能力得到有效的提高.

圖7 HAp和CeHAp樣品的BSA吸附圖

在HAp中有兩種不同的吸附位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合，分別為C位點(diǎn)和P位點(diǎn).具有正電荷的C位點(diǎn)(主要是Ca2+)將與蛋白質(zhì)中的酸性基團(tuán)(主要是-COO-)結(jié)合，而帶負(fù)電荷的P位點(diǎn)(主要是PO43-和OH-)將與堿性基團(tuán)(主要是NH3+)結(jié)合.由于BSA在PBS中帶負(fù)電荷，所以主要吸附在C位點(diǎn)[22].Ce在合成過程中替代Ca離子，有助于鈰在HAp晶格中的結(jié)合.Ce離子所帶電荷大于Ca離子所帶電荷.因此，隨著鈰摻量增加，CeHAp的正表面電荷增加，樣品的靜電吸附也增加.

3 結(jié)論

(1)采用化學(xué)沉淀法合成了CeHAp顆粒，通過調(diào)節(jié)Ca和Ce的投料比來制備不同鈰摻量的羥基磷灰石材料.

(2)結(jié)構(gòu)表征揭示了CeHAp的形成，CeHAp為棒狀結(jié)構(gòu)，隨著鈰摻量的增加，樣品晶粒尺寸減小、結(jié)晶度降低；CeHAp中存在兩種價(jià)態(tài)的Ce，即Ce3+和Ce4+.

(3)隨著Ce摻量的增加，CeHAp比表面積增加，蛋白吸附性能提高，Ce成功摻入HAp基質(zhì)中可以提高其在生物醫(yī)學(xué)骨結(jié)合和抗菌活性等方面的應(yīng)用.