基于PDMS編制多目標物核酸檢測試紙的研究

唐蕊華，劉麗娜，張素風，倪永浩，李 菲

(1.陜西科技大學 輕工科學與工程學院 輕化工程國家級實驗教學示范中心 陜西省造紙技術(shù)及特種紙品開發(fā)重點實驗室 中國輕工業(yè)紙基功能材料重點實驗室，陜西 西安 710021；2.西安交通大學 生命科學與技術(shù)學院 生物醫(yī)學信息工程重點實驗室 仿生工程與生物力學中心，陜西 西安 710049)

0 引言

核酸作為生命體最基本的物質(zhì)之一，攜帶有大量信息，在動物、植物和微生物的生長、遺傳和變異中起決定性作用，已被作為目標物廣泛用于疾病診斷、食品安全檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域[1-5].目前，常用的核酸檢測技術(shù)主要包括聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)和等溫擴增技術(shù)等[3,6,7].但這些技術(shù)需要專業(yè)技術(shù)人員在實驗室使用大型的儀器才能完成，存在成本昂貴、耗時、操作復雜和不便攜等缺點，難以廣泛用于資源受限地區(qū)(如床旁檢測)的快速檢測中.因此，發(fā)展快速的核酸檢測技術(shù)具有重要意義.

紙作為日常生活中隨處可見的材料，具有成本低廉、便攜、生物相容性好和靠毛細作用力工作而不需要額外驅(qū)動泵等優(yōu)點，已被用于研發(fā)紙基核酸檢測技術(shù)實現(xiàn)快速檢測[8-11]，如艾滋病病毒(HIV)核酸檢測試紙[3,9,12]、乙型肝炎病毒(HBV)核酸檢測試紙[13]和沙門氏菌核酸試紙檢測[14]等.但此類試紙為單一目標物的檢測，而臨床檢測中往往同一份樣本會涉及多種疾病，需要進行多次單獨檢測才能得到診斷結(jié)果.因此，需要開發(fā)多目標物核酸檢測試紙.

目前，已有研究報道多種紙基多目標物核酸檢測技術(shù).例如，Takahashi課題組在一根試紙條上劃出多條檢測線得到了多目標物試紙型DNA生物傳感器，可同時檢測口腔中的五種病原微生物[15]，但其檢測線的數(shù)量受到試紙條長度的限制.Tabeling課題組和Henry課題組分別采用噴蠟打印機將蠟打印在紙上形成疏水圖形，制備得到了紙基埃博拉病毒RNA[16]和DNA多目標物檢測生物傳感器[17].但此類制備過程中需要石蠟打印機且操作需將多層紙折疊在一起才能完成檢測，存在制備成本昂貴、操作復雜等缺陷.另外，蠟受到溫度影響導致制備的疏水區(qū)域形狀不穩(wěn)定.因此，研究一種制備成本低廉、操作簡單和檢測線不受限制的多目標物核酸檢測試紙具有重要意義.

本課題組在前期研究中開發(fā)了一種基于壓力輔助的圓珠筆技術(shù)，可將蠟和液態(tài)金屬手寫在紙基材料表面，并通過加熱熔化或自然風干的方式制備出疏水圖案或紙基電極，成本低廉、操作簡單[18].基于此研究基礎(chǔ)，本研究擬采用壓力輔助的圓珠筆芯技術(shù)將聚二甲基硅氧烷(PDMS)書寫在硝酸纖維素膜和結(jié)合墊表面，室溫固化后PDMS在紙上形成疏水線，制備得到核酸多目標檢測試紙.對HBV和HIV核酸目標物進行檢測，實驗結(jié)果得知HBV/HIV核酸試紙具有高度特異性.HBV和HIV的檢測限分別為0.5 nM和0.25 nM.此技術(shù)制備的多目標物核酸檢測試紙具有操作簡單、成本低廉的優(yōu)點，可用于其它多目標物檢測試紙的制備中.

1 材料與方法

1.1 材料

牛血清白蛋白 (BSA)、磷酸鹽緩沖液(PBS)和十二烷基磺酸鈉(SDS),購自美國MP公司；吐溫 20、Tris (2-carboxyethyl)-phosphine (TCEP)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和鏈霉親和素,購自美國Sigma-Aldrich公司；氯金酸,購自麥克林；檸檬酸三鈉、氯化鈉,購自天津天力化學試劑有限公司；20×SSC緩沖液,購自美國Invitrogen公司；試紙條上的HBV和HIV對照探針、捕獲探針和檢測探針,由上海捷瑞生物工程有限公司合成.試紙條材料：背膠板、吸水墊、硝酸纖維素膜(Millipore HFB18002,USA)、結(jié)合墊和樣品墊,均購自上海杰一生物技術(shù)有限公司.本研究中所有的其它化學試劑均為分析純.

1.2 核酸序列的設(shè)計

本研究所用的HIV核酸序列[5]和HBV核酸序列[13]根據(jù)參考文獻合成.其他核酸序列來自于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide核酸數(shù)據(jù)庫，并用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計完成(詳細序列見表1).

1.3 納米金的制備

13 nm直徑的膠體金顆粒是利用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備而成，具體過程參照文獻[9].首先，將三口圓底燒瓶和冷凝管浸泡于酸缸，使用前沖洗干凈.將圓底燒瓶和冷凝管固定在鐵架臺上，磁力加熱攪拌器置于圓底燒瓶底下，冷凝管與數(shù)控超級恒溫槽相連.其次，將100 mL ddH2O加入圓底燒瓶中，磁力攪拌加熱至沸騰；之后，用移液器加入4.5 mL 1% 檸檬酸鈉；3 min后加入1.2 mL 0.825% 氯金酸；這個過程中液體的顏色會由淡黃色到藍色再到紫色，最后變?yōu)榫萍t色.反應30 min后，將制備好的13 nm的膠體金倒入50 mL離心管中，室溫保存?zhèn)溆?

1.4 納米金與核酸探針的修飾

(1)檢測探針的修飾：首先，分別加入20μL和25μL 500 mM的醋酸溶液(pH 4.76)，4μL和5μL 10 mM TCEP，100μL和126μL ddH2O到HIV檢測探針和HBV檢測探針中，使HIV和HBV檢測探針的終濃度達到100μM.溫反應1 h后，將124μL的HIV檢測探針和156μL的HBV檢測探針各自加入20 mL已制備好的13 nm的納米金溶液中.室溫反應16 h后，分別加入219.8μL 和221μL 1% SDS使其終濃度為0.01%.1 h后，分別往HIV和HBV溶液中加入1.785 mL 和1.772 mL 2 M NaCl溶液使其終濃度為160 mM.室溫反應24 h后，取標記好的納米金溶液14 000 g離心20 min，棄上清.用重懸緩沖液重懸，滴加在試紙條上，烘干進行檢測.

(2)HIV對照探針和捕獲探針的修飾：加入57.6μL 2 mg/ml的鏈霉親和素(用PBS溶解)和10μL PBS到7.56 nM對照探針中，室溫反應1 h，加入7.6μL無水乙醇使其終濃度為100μM；加入55μL 2 mg/ml的鏈霉親和素(用PBS溶解)和9.7μL PBS到7.2 nM捕獲探針中，室溫反應1 h，加入7.3μL無水乙醇使其終濃度為100μM.

(3)HBV對照探針和捕獲探針的修飾：加入32μL 2 mg/mL的鏈霉親和素(用PBS溶解)和5.7μL PBS到4.2 nM對照探針中，室溫反應1 h，加入4.26μL無水乙醇使其終濃度為100μM；加入27.5μL 2 mg/ml的鏈霉親和素(用PBS溶解)和4.83μL PBS到3.6 nM捕獲探針中，室溫反應1 h，加入3.7μL無水乙醇使其終濃度為100μM.

(4)目標物的制備：用4×SSC溶液溶解目標物使其終濃度為10μM.使用時根據(jù)實驗所需進行稀釋.

1.5 試紙的制備

試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和背膠板組成.

(1)將樣品墊(15 mm×7 mm×0.8 mm)、結(jié)合墊(10 mm×7 mm×0.2 mm)、硝酸纖維素膜(20 mm×7 mm×0.01 mm)和吸水紙(25 mm×7 mm×0.668 mm)按照此順序兩兩相重疊2 mm粘貼在背膠板(60 mm×7 mm×0.2 mm)上.

(2)用程序剪切儀將其切割成7 mm寬的試紙條.

(3)用壓力輔助圓珠筆將PDMS書寫在硝酸纖維素膜的中間，制備疏水隔離線.

(4)用移液器將HIV和HBV的對照探針(C線)和捕獲探針(T線) 滴加于硝酸纖維素膜上和將已修飾的HIV和HBV納米金滴加于結(jié)合墊上，37 ℃烘干2 h用于檢測.

1.6 試紙?zhí)禺愋詸z測

(1)單目標物核酸試紙的檢測：分別用100 nM的HBV、HIV、丙型肝炎病毒(HCV)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes) 、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)和陰性對照作為目標物進行檢測，驗證HBV核酸試紙和HIV核酸試紙的特異性.

(2)多目標物核酸檢測試紙的檢測：分別用50 nM的HBV和HIV混合溶液、丙型肝炎病毒(HCV)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes) 、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)和陰性對照為目標物進行檢測，驗證多目標物核酸檢測試紙的特異性.

表1 核酸探針序列

1.7 試紙靈敏性檢測

(1)單目標物核酸試紙的檢測：分別用100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1 nM、0.5 nM、0.25 nM、0.1 nM和0.05 nM不同濃度的HBV和HIV合成序列和陰性對照檢測單目標物核酸試紙，確定單目標核酸試紙的檢測靈敏度.

(2)多目標物核酸試紙的檢測：用100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1 nM、0.5 nM、0.25 nM、0.1 nM、0.05 nM的HBV和HIV混合溶液和陰性對照分別檢測多目標核酸試紙，確定多目標核酸試紙的檢測靈敏度.

1.8 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有實驗均重復三次，檢測結(jié)果的定量分析采用IPP6.0軟件，所有實驗結(jié)果都為Mean±SD.

2 結(jié)果與討論

2.1 多目標物核酸檢測試紙的設(shè)計

為了克服前人工作中存在的制備成本昂貴、操作復雜和不穩(wěn)定等缺陷，本研究開發(fā)了一種基于PDMS的多目標物核酸檢測試紙，如圖1所示.

該試紙的制備過程如圖1(a)所示：采用壓力輔助圓珠筆將PDMS寫于試紙條NC膜和結(jié)合墊中線處，在室溫下凝固形成一道疏水線，目的是將不同目標物的檢測區(qū)域分隔開.之后，將已修飾的HBV和HIV納米顆粒、對照線(C)和檢測線(T)分別滴加在結(jié)合墊和NC膜相應位置，37 ℃烘干備用.

檢測流程如圖1(b)所示：將HBV和HIV混合目標物滴加于樣品墊上進行檢測，通過顯色情況判定結(jié)果：呈陽性或者陰性.核酸試紙的檢測原理是根據(jù)堿基互補配對原則，在檢測時，目標物序列的兩端分別與納米金表面的檢測探針和捕獲探針結(jié)合形成三明治結(jié)構(gòu)在檢測線處顯色，納米金表面檢測探針與對照探針結(jié)合在對照線處顯色.此試紙制備過程中采用的壓力輔助圓珠筆均為常用的筆芯和注射器(成本約0.000 2萬元)，相比于石蠟打印機(成本約2.5萬元)，大大降低了制備成本；PDMS是通過劃線的方式書寫在結(jié)合墊和NC膜表面，只需要直尺，無需專業(yè)的制圖軟件和技術(shù)人員均可實現(xiàn)，制備過程簡單；此多目標物試紙是平行檢測多個目標物，檢測線條數(shù)不受NC膜長度的限制，可根據(jù)實際需要制備多條檢測線；PDMS凝固后不受溫度變化的影響，疏水線穩(wěn)定不變形.因此，本研究所制備的多目標物檢測試紙具有成本低廉、操作簡單和穩(wěn)定的優(yōu)點，可推廣于其他多目標物檢測應用中.

(a)試紙制備過程 (b)試紙檢測過程圖1 多目標物檢測試紙示意圖

2.2 單一目標物的檢測

在實際檢測中，由于HBV和HIV核酸檢測經(jīng)常會受到其他傳染性疾病的干擾.因此，本研究使用了100 nM的HBV、HIV、HCV、副溶血性弧菌、李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的合成序列和陰性對照作為待檢物分別檢測了HBV和HIV單目標物試紙，分別驗證HBV(結(jié)果如圖2所示)和HIV核酸試紙的特異性(結(jié)果如圖3所示).

從圖2(a)觀察到，高濃度的干擾物質(zhì)用于HBV核酸試紙檢測時，只有目標物為HBV的試紙檢測結(jié)果呈陽性，其它目標物檢測結(jié)果呈陰性；同時，通過圖2(b)灰度定量結(jié)果觀察，只有目標物HBV試紙灰度值明顯高于其他干擾目標的灰度值，說明干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響，證明HBV核酸試紙的檢測具有高度特異性.

從圖3(a)觀察到高濃度的干擾物質(zhì)用于HIV核酸試紙檢測時，只有目標物為HIV的試紙檢測結(jié)果呈陽性，其它目標物檢測結(jié)果均為陰性；同時，通過圖3(b)的灰度定量結(jié)果觀察，只有目標物HIV的試紙灰度值明顯高于其他干擾目標的灰度值，說明干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果不產(chǎn)生影響，證明HIV核酸試紙的檢測具有高度特異性.

(a)HBV試紙?zhí)禺愋詸z測試紙顯色結(jié)果

(b)HBV試紙?zhí)禺愋詸z測試紙灰度定量結(jié)果圖2 HBV單一目標物試紙?zhí)禺愋詸z測 (1-HBV;2-HIV;3-HCV;4-副溶血弧菌;5-李斯特菌;6-大腸桿菌;7-金黃色葡萄球菌;8-沙門氏菌;9-陰性對照)

(a)HIV試紙?zhí)禺愋詸z測試紙顯色結(jié)果

(b)HIV試紙?zhí)禺愋詸z測試紙灰度定量結(jié)果圖3 HIV單一目標物試紙?zhí)禺愋詸z測 (1-HIV;2-HCV;3-HBV;4-副溶血弧菌;5-李斯特菌;6-大腸桿菌;7-金黃色葡萄球菌;8-沙門氏菌;9-陰性對照)

為了評價單一目標物試紙的檢測靈敏度，本研究用100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、5 nM、2.5 nM、1 nM、0.5 nM、0.25 nM、0.1 nM、0.05 nM不同濃度的HBV和HIV樣本和陰性對照分別對HBV和HIV核酸試紙進行檢測，其結(jié)果分別如圖4和圖5所示.

(a)HBV試紙靈敏性檢測試紙顯色結(jié)果

(b)HBV試紙靈敏性檢測試紙灰度定量結(jié)果圖4 HBV單一目標物試紙靈敏性檢測 (1-100 nM;2-50 nM;3-25 nM;4-10 nM;5-5 nM;6-2.5 nM;7-1 nM;8-0.5 nM;9-0.25 nM;10-0.1 nM;11-0.05 nM;12-陰性對照)

從圖4(a)顯色結(jié)果可以觀察到HBV試紙條的檢測限為0.5 nM，定量分析結(jié)果如圖4(b)，從圖中可以觀察到其灰度值隨著樣品濃度的降低逐漸降低；同樣，從圖5(a)顯色結(jié)果可以觀察到HIV試紙條的檢測限為0.25 nM，定量分析結(jié)果如圖5(b)，其灰度值隨著樣品濃度的降低逐漸降低.

(a)HIV試紙靈敏性檢測試紙顯色結(jié)果

(b)HIV試紙靈敏性檢測試紙灰度定量結(jié)果圖5 HIV單一目標物試紙靈敏性檢測 (1-100 nM;2-50 nM;3-25 nM;4-10 nM;5-5 nM;6-2.5 nM;7-1 nM;8-0.5 nM;9-0.25 nM;10-0.1 nM;11-0.05 nM;12-陰性對照)

2.3 多目標物的檢測

在驗證了單一目標物試紙?zhí)禺愋院挽`敏性的基礎(chǔ)上，為了進一步驗證本研究所制備的多目標物核酸檢測試紙性能，后續(xù)工作中，本研究分別驗證了多目標物試紙的特異性和靈敏性.首先，用100 nM的HBV和HIV混合樣本、干擾目標物(HCV、副溶血性弧菌、李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌)和陰性對照驗證了多目標物核酸檢測試紙的特異性，其結(jié)果如圖6所示.從圖6(a)中可以觀察到HBV和HIV混合樣本的檢測結(jié)果呈陽性，其它干擾物的檢測結(jié)果均為陰性，其定量結(jié)果圖6(b)的結(jié)果與顯色結(jié)果相一致.

其次，用不同濃度的HBV和HIV混合目標物對多目標核酸試紙的靈敏性進行了檢測，其結(jié)果如圖7所示.從圖7(a)的顯色情況觀察，在多目標核酸試紙中HBV(左)的最低檢測限到0.5 nM，HIV(右)的最低檢測限到0.25 nM；從圖7(b)中觀察到的灰度值與其顯色結(jié)果相一致.從以上結(jié)果分析：多目標物試紙與單目標物試紙的檢測結(jié)果(特異性和靈敏度)均一致，這說明本研究制備的多目標物核酸檢測試紙檢測可靠.

(a)HBV和HIV混合目標物試紙?zhí)禺愋詸z測顯色結(jié)果

(b)HBV和HIV混合目標物試紙?zhí)禺愋詸z測灰度定量結(jié)果圖6 多目標物試紙?zhí)禺愋詸z測 (1-HBV和HIV;2-HCV;3-副溶血弧菌;4-李斯特菌;5-大腸桿菌;6-金黃色葡萄球菌;7-沙門氏菌;8-陰性對照. 結(jié)果觀察：HBV(左);HIV(右))

(a)HBV和HIV混合目標物試紙靈敏性檢測顯色結(jié)果

(b)HBV和HIV混合目標物試紙靈敏性檢測灰度定量結(jié)果圖7 多目標物試紙靈敏性檢測 (1-100 nM;2-50 nM;3-25 nM;4-10 nM;5-5 nM;6-2.5 nM;7-1 nM;8-0.5 nM;9-0.25 nM;10-0.1 nM;11-0.05 nM;12-陰性對照.結(jié)果觀察：HBV(左);HIV(右))

3 結(jié)論

本研究利用壓力輔助的圓珠筆技術(shù)將PDMS書寫在試紙的結(jié)合墊和硝酸纖維素膜上形成疏水線，從而制備了多目標物核酸檢測試紙.通過實驗驗證此多目標物核酸試紙可以特異靈敏的同時檢測HBV和HIV核酸樣本.該方法成本低廉、操作簡單且穩(wěn)定，為多目標物檢測試紙的研究提供有效的手段.