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    轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用研究

    2018-12-07 09:19:04陳茜圓黃曉軍任卓超金興
    浙江醫(yī)學(xué) 2018年22期
    關(guān)鍵詞:組肺勻漿肺泡

    陳茜圓 黃曉軍 任卓超 金興

    急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性彌漫性肺損傷和進(jìn)而發(fā)展的急性呼吸衰竭。ALI已成為嚴(yán)重感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷和大面積燒傷等患者死亡的主要原因之一。ALI的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明,目前尚無(wú)強(qiáng)力的、安全有效的藥物治療手段。故進(jìn)一步研究ALI的發(fā)病機(jī)制,探尋新的方法預(yù)防和治療ALI,刻不容緩。研究表明,被激活的各種細(xì)胞經(jīng)呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起氧化應(yīng)激狀態(tài),在ALI發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[1-2]。在生理情況下ROS是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant responsive element,ARE)調(diào)控的相關(guān)解毒、抗氧化酶去除和降解的。Venugopal等[3]和Itoh等[4]最先提出轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)在驅(qū)動(dòng)ARE調(diào)控基因中的作用,后續(xù)研究使得Nrf2參與ARE調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制越來(lái)越清楚[5]。目前研究已證實(shí)Nrf2在一系列高氧化應(yīng)激狀態(tài)的疾病中都有保護(hù)作用,并決定機(jī)體對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性和機(jī)體炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度[6-8]。國(guó)外已有少量研究證實(shí)Nrf2在ALI中的保護(hù)作用,但在國(guó)內(nèi)此類研究報(bào)道極少[9]。Nrf2的研究將為臨床上ALI的預(yù)防和治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。本研究探討Nrf2對(duì)ALI小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6~8周雄性小鼠36只,清潔級(jí)Ⅱ級(jí),體質(zhì)量18~20g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。室溫(18~22℃)、安靜環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng),晝夜交替,自由適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.2 儀器和試劑 Gem premier 3000血?dú)夥治鰞x(美國(guó)GE公司);IX51光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad公司);脂多糖(LPS)(美國(guó)Sigma公司)提供;Nrf2 小干擾 RNA(siRNA)、鼠抗人Nrf2單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz生物科技公司);髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所);一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α、IL-6、考馬斯亮藍(lán)染色法(Braford)蛋白含量檢測(cè)、Western blot檢測(cè)、全蛋白抽提檢測(cè)和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制作 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、ALI組、Nrf2干擾溶劑對(duì)照組(干擾溶劑組)和Nrf2干擾組4組,每組9只。Nrf2干擾組于尾靜脈注射Nrf2 siRNA 3mg/kg(溶于0.2ml干擾溶劑),而干擾溶劑組于尾靜脈注射等量干擾溶劑(1×PBS,溶解隨機(jī)序列siRNA),對(duì)照組和ALI組于尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液,1次/d,連續(xù)3d。第4天時(shí),ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組腹腔注射LPS 10mg/kg(溶于0.2ml 0.9%氯化鈉溶液),制備內(nèi)毒素誘發(fā)ALI模型;對(duì)照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。注射LPS或0.9%氯化鈉溶液6h后,配制10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉成功,再由腹主動(dòng)脈取血,采用Gem premier 3000型血?dú)夥治鰞x進(jìn)行血?dú)夥治?,?jì)算氧合指數(shù)[PaO2/吸入氧濃度(FiO2)],以氧合指數(shù)≤300mmHg為 ALI模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)[10]。36只小鼠由下腔靜脈取血,放血處死后,從胸腔中取出肺組織。

    1.4 肺組織勻漿收集 取左肺組織用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿,制備為10%組織勻漿。取0.45ml 10%組織勻漿用于測(cè)定MPO;剩余組織勻漿用低溫離心機(jī)離心,10 000r/min離心10min,收集上清液置于-80℃保存,以備各項(xiàng)檢測(cè)用。

    1.5 肺組織病理學(xué)觀察 取右肺副葉肺組織,0.9%氯化鈉溶液浸洗后,10%甲醛固定,經(jīng)梯度乙醇脫水置換、二甲苯透明后,常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,Olympus IX51光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化,參照文獻(xiàn)[11]介紹的方法進(jìn)行肺組織病理學(xué)損傷評(píng)分:(1)肺泡腔及間隔中性粒細(xì)胞滲出:無(wú)滲出為0分,可疑滲出為1分,散在滲出為2分,滲出較多或呈小灶狀分布為3分;(2)肺泡間隔增寬:無(wú)增寬為0分,稍有增寬為1分,明顯增寬為2分,喪失正常肺泡結(jié)構(gòu)為3分;(3)肺泡腔出血:腔內(nèi)無(wú)紅細(xì)胞為0分,有少數(shù)紅細(xì)胞為1分,紅細(xì)胞較多為2分,紅細(xì)胞幾乎充滿肺泡腔為3分;(4)肺泡腔纖維蛋白滲出:無(wú)滲出為0分,少許滲出為1分,滲出較多為2分,幾乎充滿肺泡腔為3分。取4項(xiàng)評(píng)分之和為肺組織病理學(xué)損傷評(píng)分。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分,取其平均值。

    1.6 測(cè)定濕重/干重比值 取右肺尖葉肺組織,稱濕重,置入80℃烘箱內(nèi)烘24h后稱干重,測(cè)定肺組織濕重/干重比值。

    1.7 Nrf2核蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。小鼠肺組織勻漿用全蛋白抽提檢測(cè)試劑盒提取蛋白,Bradford法定量。取80μg蛋白進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,加入鼠抗人Nrf2單克隆抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜,次日TBST漂洗3次,加入二抗(1∶10 000稀釋)孵育后予以顯色,使用凝膠成像分析系統(tǒng)G:BOXChemiXR5成像,Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析,以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的條帶積分光密度值之比反映目的蛋白的表達(dá)水平。

    1.8 肺組織中MPO、iNOS水平檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書,采用比色法檢測(cè)MPO、iNOS水平。

    1.9 血清TNF-α和IL-6水平檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書,采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α和IL-6水平。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 肺組織形態(tài)學(xué)變化 ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織切片炎癥反應(yīng)顯著,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)肺泡間隔、肺泡腔,其中以中性粒細(xì)胞為主;支氣管壁增厚,可見肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大、肺泡間隔斷裂。上述3組中又以Nrf2干擾組炎癥反應(yīng)最明顯,而對(duì)照組未見上述炎癥反應(yīng),見圖1(插頁(yè))。與對(duì)照組比較,ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織病理學(xué)損傷評(píng)分升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與ALI組比較,Nrf2干擾組肺組織病理學(xué)損傷評(píng)分升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表 1。

    表1 4組小鼠肺組織病理學(xué)損傷評(píng)分比較(分)

    2.2 4組小鼠肺組織濕重/干重比值比較 與對(duì)照組比較,ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織濕重/干重比值升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與ALI組比較,Nrf2干擾組肺組織濕重/干重比值升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表 2。

    2.3 4組小鼠肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較,ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與ALI組比較,Nrf2干擾組肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

    表2 4組小鼠肺組織濕重/干重比值比較

    表3 4組小鼠肺組織Nrf 2核蛋白表達(dá)水平比較

    2.4 4組小鼠肺組織MPO、iNOS水平比較 與對(duì)照組比較,ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組肺組織MPO、iNOS水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與ALI組比較,Nrf2干擾組肺組織MPO、iNOS水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表4。

    表4 4組小鼠肺組織M PO、i NOS水平比較

    2.5 4組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較 與對(duì)照組比較,ALI組、干擾溶劑組和Nrf2干擾組血清IL-6、TNF-α水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與ALI組比較,Nrf2干擾組血清TNF-α、IL-6水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表5。

    3 討論

    內(nèi)毒素誘發(fā)ALI在臨床中十分常見,往往也是多器官功能障礙發(fā)生的啟動(dòng)原因。ALI一直是基礎(chǔ)及臨床研究中的重點(diǎn)及難點(diǎn),總體臨床救治效果仍不理想,死亡率較高。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,有待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)建立小鼠ALI模型,評(píng)價(jià)Nrf2對(duì)ALI的保護(hù)作用,以了解在ALI中Nrf2作為治療靶點(diǎn)的可行性,為找到有效的治療措施提供依據(jù)。

    表5 4組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較(pg/m l)

    臨床上很多疾病都容易誘發(fā)內(nèi)毒素相關(guān)性ALI。本研究采用腹腔注射LPS 10mg/kg建立小鼠ALI模型,結(jié)果表明ALI組、干擾溶劑組和Nrf2組于注射LPS 6h后肺損傷評(píng)分和肺組織濕重/干重比值均升高,提示ALI制備成功。

    本研究顯示LPS可增加肺組織Nrf2核蛋白表達(dá),考慮與LPS能激活機(jī)體氧化應(yīng)激系統(tǒng)有關(guān)。而此期間肺組織損傷程度加重,說(shuō)明內(nèi)源性免疫系統(tǒng)反應(yīng)升高Nrf2以對(duì)抗損傷,但是此保護(hù)作用不足以對(duì)抗此期間炎癥介質(zhì)的致?lián)p傷作用,故最終結(jié)果仍然顯示為肺臟損傷程度加重。本研究還發(fā)現(xiàn),與ALI組比較,Nrf2干擾組肺組織Nrf2核蛋白表達(dá)水平下調(diào),LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI嚴(yán)重程度加重,血清促炎癥因子水平和肺組織中氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)升高。提示Nrf2對(duì)ALI的保護(hù)作用與其抗炎和抗氧化作用有關(guān)。

    Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物表達(dá)的關(guān)鍵性因子,具有維持細(xì)胞氧化-抗氧化平衡、抑制凋亡及抗炎的多重生物活性。Nrf2與胞質(zhì)接頭蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1)及ARE共同構(gòu)成Keap1-Nrf2-ARE通路[5]。Nrf2主要在代謝性器官、解毒器官以及與外界相通的器官中高表達(dá),如腦、腎、肺和腸等[8-9,12]。正常生理狀態(tài)下,Nrf2定位于胞質(zhì),與Keap1形成復(fù)合物,并由Keap1促進(jìn)Nrf2降解,使Nrf2維持在較低水平。當(dāng)機(jī)體存在氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí),Nrf2磷酸化并從Keap1蛋白上解離出來(lái),隨即活化轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合到ARE上,啟動(dòng)其下游多個(gè)抗氧化基因及解毒酶等的轉(zhuǎn)錄翻譯,來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激[5]。研究證實(shí),經(jīng)NRF2信號(hào)通路調(diào)控的保護(hù)性基因數(shù)量龐大,這些保護(hù)性基因包含抗氧化蛋白類基因、Ⅱ相解毒酶類基因和抗炎因子類基因等。其中抗氧化蛋白類基因是這些保護(hù)性基因中非常重要的一類,包括超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶1、依賴還原型輔酶/Ⅱ醌氧化還原酶l等[13]。Nrf2可以抵抗炎癥刺激,抑制細(xì)胞組織受到炎癥損傷[8,14]。炎癥標(biāo)志物如IL-6、TNF-α等可用于炎癥疾病患者預(yù)后的評(píng)估[15]。

    Lyu等[16]發(fā)現(xiàn)基因敲除Nrf2可以加劇小鼠膿毒癥器官損害程度,增加死亡率。Kim等[17]研究顯示,相對(duì)于野生型小鼠,Nrf2敲除小鼠ALI的損傷程度更重,提示Nrf2信號(hào)通路是ALI保護(hù)的關(guān)鍵位點(diǎn)。鄭丹等[18]發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸阻斷Nrf2-ARE通路可加重兔內(nèi)毒素休克誘發(fā)的ALI。本研究顯示,與ALI組比較,Nrf2干擾組肺損傷評(píng)分和肺組織濕重/干重比值升高,各氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)升高,提示Nrf2的表達(dá)對(duì)ALI有保護(hù)作用。

    綜上所述,Nrf2通過(guò)抗炎和抗氧化功能對(duì)內(nèi)毒素誘發(fā)小鼠ALI時(shí)的機(jī)體起到保護(hù)作用。

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