細胞游離血紅蛋白對小鼠膿毒癥肺損傷的影響

畢興華,周龍媛，蔡 暢，漆 勇，李 炎

(寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院麻醉科，浙江寧波 315040)

膿毒癥是指嚴重感染引起的全身炎癥反應，多發(fā)生于大手術(shù)后、休克或燒傷等，病死率較高[1-3]。肺是膿毒癥引起全身炎癥反應的起始靶器官，導致肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷、彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎性細胞滲出，即急性肺損傷/呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)，表現(xiàn)為進行性呼吸窘迫和低氧血癥[4-5]。膿毒癥引起紅細胞破壞，血紅蛋白釋放入血，細胞游離血紅蛋白(cell free hemoglobin，CFH)產(chǎn)生自由基、損傷血管內(nèi)皮細胞和作為損傷相關(guān)分子模式而激活炎癥反應[6-8]，但CFH對小鼠膿毒癥肺損傷的作用研究尚不明確。本研究擬建立小鼠膿毒癥模型，探討CFH對小鼠膿毒癥肺損傷的影響，為防治膿毒癥肺損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 無特定病原體BALB/c小鼠60只，雌雄不分，10～12周齡，體重20～30 g，均購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證號：SCXK(粵)2013-0002。將60只小鼠隨機分為假手術(shù)組(A組)、膿毒癥組(B組)、膿毒癥+生理鹽水組(C組)和膿毒癥+CFH組(D組)，每組15只。CFH購自美國Cell Sciences公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自中國武漢華美生物工程有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB及其抑制蛋白(IκB-α)、血紅素氧合酶(HO)-1及糖基化終末產(chǎn)物蛋白(RAGE)抗體均購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1膿毒癥模型建立 參照文獻[3,9]介紹的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)方法制備小鼠膿毒癥模型。A組小鼠僅開腹，不結(jié)扎穿孔；B、C、D組小鼠進行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)；C組術(shù)后立即氣管內(nèi)注射等量NS；D組小鼠術(shù)后立即氣管內(nèi)注射CFH 100 μg。各組小鼠術(shù)后背部均皮下注射生理鹽水0.5 mL/20 g抗休克，放回鼠籠后自由飲水和進食。本實驗中動物處置方法均符合動物倫理學標準。

1.2.2標本收集 術(shù)后24 h處死小鼠，暴露心臟和雙肺，右心室取血液標本，低溫離心10 min(1 800 r/min)后留取上清。結(jié)扎右側(cè)主支氣管，用預冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分灌洗左肺并收集肺泡灌洗液(ALF)。剪開左心耳處心肌，經(jīng)右心室灌注PBS，沖洗左肺至肺組織變白后保留肺組織。所有標本保存在-80 ℃待檢。

1.2.3肺組織濕/干質(zhì)量比值(W/D)測定 取小鼠新鮮右肺組織稱取濕質(zhì)量(W)后，置恒溫烤箱(75 ℃)中烘烤48 h至恒質(zhì)量，稱取干質(zhì)量(D)并計算W/D值，評估肺組織水腫程度。

1.2.4ALF細胞計數(shù)及總蛋白測定 取出ALF低溫離心10 min(1 400 r/min)，PBS 溶解沉淀后用改良Neubauer計數(shù)板進行細胞計數(shù)。采用BCA法檢測ALF總蛋白水平，嚴格按照BCA蛋白檢測試劑盒說明書進行操作。

1.2.5肺組織病理學觀察及評分 左肺組織行蘇木素-伊紅染色。光鏡下觀察并拍照，肺損傷病理學評分。評分根據(jù)以下方面：肺泡是否充血水腫；肺泡腔有無出血；白細胞有無滲出；肺泡間質(zhì)是否損傷。每個評分標準：0分輕微；1分輕度；2分中度；3分重度；4分嚴重[10]。

1.2.6ELISA檢測血清及ALF中TNF-α和IL-1β表達 采用ELISA檢測血清及ALF中TNF-α和IL-1β的水平，實驗操作嚴格按照說明書步驟進行。

1.2.7免疫組織化學檢測肺組織NF-κB、IκB-α、HO-1及RAGE蛋白表達 切片脫蠟后封閉，加相應的一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后加辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1.0 h，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色和蘇木素染核，光鏡下觀察目標蛋白的表達情況，細胞及周圍組織呈現(xiàn)褐色即為陽性表達。陰性對照用PBS 4 ℃孵育過夜，采用HMIAS-2000型全自動圖像分析系統(tǒng)拍照并分析。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠肺組織W/D比值及病理學評分等比較 與A組比較，B、C、D組小鼠肺組織W/D比值、病理學評分、總蛋白水平和細胞計數(shù)均明顯增加(P<0.05)。與B、C組比較，D組小鼠肺組織W/D比值、病理學評分、總蛋白水平和細胞計數(shù)均明顯增加(P<0.05)；但B、C組間肺組織W/D比值、病理學評分、總蛋白水平和細胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠肺組織W/D比值及病理學評分等比較

a:P<0.05，與A組比較；b：P<0.05，與D組比較

2.2各組小鼠肺組織病理學改變 A組小鼠肺組織無明顯病理學改變；B、C組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)充血水腫，肺泡內(nèi)見炎性細胞和紅細胞滲出；D組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂，肺間質(zhì)嚴重充血水腫，肺泡內(nèi)有大量的炎性細胞和紅細胞滲出，見圖1。

圖1 各組小鼠光鏡下肺組織病理學改變(×100)

2.3各組小鼠血清及ALF中炎癥因子表達水平比較 與A組比較，B、C、D組小鼠血清及ALF中炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均增加(P<0.05)；與B、C組比較，D組小鼠血清及ALF中炎癥因子TNF-α和IL-1β水平均明顯增加(P<0.05)；但B、C組間小鼠血清及ALF中TNF-α和IL-1β水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4各組小鼠肺組織NF-κB、IκB-α、HO-1及RAGE蛋白質(zhì)表達 與A組比較，B、C、D組小鼠肺組織NF-κB、HO-1及RAGE表達均上調(diào)，而IκB-α表達下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。D組小鼠肺組織NF-κB、HO-1及RAGE表達均較B、C組明顯升高，而IκB-α表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B、C組小鼠肺組織NF-κB、HO-1及RAGE表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

表2 各組小鼠血清及ALF中炎癥因子水平比較

a:P<0.05,與A組比較；b:P<0.05,與D組比較

圖2 各組小鼠肺組織NF-κB、IκB-α、HO-1及RAGE表達水平(×100)

3 討 論

膿毒癥患者起病急驟，多數(shù)可導致ALI/ARDS、休克和多器官功能障礙綜合征(MODS)。炎性細胞激活和炎癥因子釋放是膿毒癥肺損傷發(fā)展的主要因素，肺損傷的早期出現(xiàn)是引起膿毒癥患者死亡的重要原因，其發(fā)病機制目前尚不明確。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)建立小鼠的膿毒癥模型，手術(shù)引起的組織損傷、結(jié)扎引起的組織壞死、混有細菌的腸內(nèi)容物引起感染，引起腹膜炎和腸道細菌移位，激活免疫系統(tǒng)并導致呼吸、循環(huán)等系統(tǒng)衰竭、休克和MODS。本課題組發(fā)現(xiàn)B、C組小鼠肺組織明顯水腫、病理學損傷和炎癥反應嚴重，同時炎癥蛋白NF-κB表達上調(diào)和IκB-α表達下調(diào)，提示小鼠膿毒癥肺損傷模型成功建立。

與B、C組比較，D組小鼠肺組織明顯水腫、病理學損傷和炎癥反應明顯增加，同時炎癥蛋白NF-κB表達明顯上調(diào)，提示CFH加重了小鼠膿毒癥肺損傷。CFH是紅細胞在病理情況下大量破壞，血紅蛋白釋放入血，產(chǎn)生自由基、損傷血管內(nèi)皮細胞和作為損傷相關(guān)分子模式而激活免疫炎癥反應[6-8]。膿毒癥引起的ARDS常引起肺泡內(nèi)大量紅細胞滲出并發(fā)生溶血[11]，因此升高的CFH可能參與并激活ARDS的免疫炎癥反應，加重ARDS。SHAVER等[12]研究發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)注射外源性CFH導致呼吸機相關(guān)性肺損傷的肺泡毛細血管通透性增加、炎癥反應和肺泡上皮細胞損傷明顯加重。

本研究發(fā)現(xiàn)，CFH處理后小鼠肺組織HO-1和RAGE蛋白表達明顯上調(diào)，提示CFH加重膿毒癥小鼠ALI可能與HO-1表達有關(guān)。RAGE是診斷ALI的敏感指標[13-14]，其表達明顯上調(diào)與肺損傷的嚴重程度呈正相關(guān)性。有研究表明，CFH與結(jié)合珠蛋白結(jié)合并形成復合體，被肺泡巨噬細胞表面的CD163識別和攝取，上調(diào)效應酶HO-1的表達[15-16]。HO-1可能在膿毒癥ALI中起到抗炎和抗氧化性組織損傷的作用，對膿毒癥ALI的免疫和炎癥反應平衡具有十分重要的意義[17]。但本研究發(fā)現(xiàn)，HO-1表達上調(diào)并不能改善膿毒癥ALI的炎癥反應和組織損傷，可能與氧化應激與抗氧化反應失衡有關(guān)。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應中細胞因子、炎癥介質(zhì)和黏附分子基因轉(zhuǎn)錄過程的序列特異性DNA結(jié)合蛋白，在免疫炎癥反應中起著非常關(guān)鍵的作用[18]。膿毒癥發(fā)生的MODS常伴有NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路的上調(diào)活化[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，CFH處理后小鼠肺組織NF-κB蛋白表達明顯上調(diào)，而其抑制蛋白IκB-α表達明顯下調(diào)，提示NF-κB蛋白可能參與了膿毒癥肺損傷的炎癥反應。

綜上所述，CFH加重小鼠膿毒癥肺損傷，表現(xiàn)為肺水腫、形態(tài)學損傷、炎癥因子TNF-α和IL-1β水平增加，炎癥蛋白NF-κB和RAGE表達上調(diào)，可能與HO-1表達有關(guān)。