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    吡格列酮調(diào)控離體新生大鼠心肌細(xì)胞增殖與肥大的研究

    2018-11-29 08:40:16
    關(guān)鍵詞:列酮吡格心肌細(xì)胞

    哺乳動物胚胎期心臟發(fā)育既有心肌細(xì)胞的增殖也有心肌細(xì)胞體積的增大,而出生后心肌細(xì)胞基本喪失了增殖能力,僅表現(xiàn)為細(xì)胞體積的增大[1-4]。同時哺乳動物出生后心臟的成熟過程中,心肌細(xì)胞的能量來源由葡萄糖代謝為主轉(zhuǎn)變成脂肪酸代謝為主[4]。有研究提示出生后心肌細(xì)胞增殖能力的改變可能與過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)相關(guān)[4-5]。而降糖藥吡格列酮的主要作用是激動PPAR-γ促進前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞和維持葡萄糖代謝和體內(nèi)平衡[6]。本研究推測,吡格列酮可能對新生大鼠心肌細(xì)胞的增殖能力存在某種影響,且目前尚未有相關(guān)的報道。

    因此,本研究旨在探討吡格列酮是否參予新生大鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat cardiac myocytes,NRCM)的增殖和肥大,為研究出生后心肌細(xì)胞增殖與肥大的機制提供一些新的線索。

    1 方法與步驟

    1.1 原代新生大鼠心肌細(xì)胞提取與培養(yǎng)

    參照已發(fā)表文獻(xiàn)中的方法進行新生大鼠心肌細(xì)胞提取與培養(yǎng),且提取的心肌細(xì)胞經(jīng)過密度梯度離心法進行了純化,去除了其中大部分的成纖維細(xì)胞與血細(xì)胞[7-9]。

    1.2 細(xì)胞加藥處理

    原代新生大鼠心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h后,用無血清的培養(yǎng)基饑餓處理過夜,然后將饑餓培養(yǎng)基吸掉一半,再將配制好的吡格列酮溶液加入到已經(jīng)饑餓處理過的心肌細(xì)胞中,搖勻,培養(yǎng)48~72 h。

    1.3 細(xì)胞增殖的檢測

    1.3.1 EDU染色 向加藥處理的NRCM中加入配制好的EDU溶液,培養(yǎng)24小時,然后進行細(xì)胞固定與EDU染色標(biāo)記[8]。

    1.3.2 免疫熒光染色 將加藥處理的NRCM先固定好,然后加入相應(yīng)的一抗孵育過夜,再加入對應(yīng)的熒光二抗,最后進行DAPI染色標(biāo)記細(xì)胞核[8]。

    1.3.3 拍照 在免疫熒光顯微鏡下對已經(jīng)完成染色的心肌細(xì)胞進行分別拍照。

    1.3.4 計數(shù) 分別計數(shù)心肌細(xì)胞總數(shù)和增殖心肌細(xì)胞數(shù)。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    本實驗主要的統(tǒng)計方法是非配對t檢驗和χ2檢驗,采用SPSS 20,GraphPad和Image J統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,以P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 EDU染色結(jié)果比較

    在NRCM培養(yǎng)基中加入10 μmol/L吡格列酮,培養(yǎng)48 h后,EDU染色(見圖1A和圖1B),統(tǒng)計分析提示:吡格列酮組NRCM的EDU陽性細(xì)胞比例高于對照組(Con), 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 6)(見圖1C)。

    圖1 兩組細(xì)胞增殖率與細(xì)胞大小比較

    2.2 Ki-67染色結(jié)果比較

    在NRCM培養(yǎng)基中加入10 μmol/L吡格列酮,培養(yǎng)48 h后,Ki-67免疫熒光染色(如圖1E和圖1F),統(tǒng)計分析提示:吡格列酮組NRCM的Ki-67陽性細(xì)胞比例高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034 7)(如圖1G)。

    2.3 NRCM細(xì)胞大小比較

    使用Image J軟件統(tǒng)計平均NRCM細(xì)胞大小,結(jié)果顯示吡格列酮組的NRCM細(xì)胞大于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.008 5)(如圖1D)。

    3 討論

    心臟發(fā)生病理性肥厚時,僅有心肌細(xì)胞的肥大而沒有心肌細(xì)胞的增殖,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞內(nèi)肌纖維的增大增粗,線粒體數(shù)量的增多和功能的增強[10]。但這種線粒體的代償遠(yuǎn)不足以滿足肥大的心肌細(xì)胞的需求,即表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的損傷和凋亡,繼而發(fā)展為心功能失代償最終進展為心衰[10]。有研究表明耐力運動等誘導(dǎo)的生理性心臟肥大,既有心肌細(xì)胞的肥大也有心肌細(xì)胞數(shù)量的增多[11-12]。Duan SZ等發(fā)現(xiàn)心臟特異性PPAR-γ敲除的小鼠會發(fā)生心室肥厚和輕度的心功能損害[13]。這可能是由于PPAR-γ的降低導(dǎo)致了參與脂肪酸氧化的蛋白表達(dá)下降,繼而由脂肪酸的利用下降促發(fā)了心臟病理性肥厚的發(fā)生。而在本實驗中發(fā)現(xiàn)吡格列酮(PPAR-γ激動劑)會促進NRCM的增殖和肥大,提示吡格列酮可能與心臟的生理性肥大相關(guān),對病理性肥大有拮抗作用。但是在我們的體外細(xì)胞實驗中,吡格列酮是通過什么機制來促進心肌細(xì)胞肥大和增殖尚不清楚。大多數(shù)的研究表明吡格列酮抑制腫瘤細(xì)胞增殖(胃癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等),在少部分腫瘤(膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤)中則表現(xiàn)為促進腫瘤細(xì)胞增殖[14]。借鑒于吡格列酮與其他細(xì)胞增殖的研究以及心肌細(xì)胞增殖調(diào)控的研究,本研究下一步的工作就是尋找吡格列酮在心肌細(xì)胞中的作用靶點及作用機制和吡格列酮在體內(nèi)與心肌細(xì)胞增殖及肥大的關(guān)系。

    本研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以促進心肌細(xì)胞的增殖并促進心肌細(xì)胞的肥大,這就提示吡格列酮可能與心臟的生理性肥厚可能存在一定的關(guān)系,并可能對病理性肥厚起到保護作用。吡格列酮的這一作用有可能為病理性心肌肥大的治療提供新的研究方向。

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