清胰湯和姜黃素調(diào)整腸道微生態(tài)對重癥急性胰腺炎的治療機(jī)制

胡煒，劉洪斌，王曼雪，張桂賢，李東華，張一

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）的高患病率、高病死率已嚴(yán)重干擾著患者的生存質(zhì)量，病死率可達(dá)20%～30%［1］。所以SAP的臨床轉(zhuǎn)歸備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。研究表明，腸道菌群可被認(rèn)為人體內(nèi)的第二大基因組，其與腸道黏膜的屏障關(guān)系密切，可以抑制病原微生物的“定植”［2］。傳統(tǒng)方法對腸道菌群進(jìn)行定向培養(yǎng)只能檢測到部分的菌群。近來，人們比較傾向于采用16S rDNA基因組測序技術(shù)來探索腸道菌群的分布，其可以比較全面地檢測到菌群的種類、豐度以及分布特征，可信度高［3］。Li等［4］研究發(fā)現(xiàn)，SAP病情發(fā)展可能與腸道微生態(tài)的平衡有關(guān)。清胰湯有抑菌、抗炎、利膽和促進(jìn)腸蠕動的作用，被證明是治療SAP的有效方劑［5］。姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多重功效，尤其在炎癥性疾病的治療中有重要地位［6］。本文通過觀察在清胰湯或姜黃素的治療下，SAP大鼠的腸道黏膜和胰腺組織的病理變化以及通過收集各組大鼠盲腸段的糞便進(jìn)行16S rDNA測序，定量分析腸腔內(nèi)菌群數(shù)量的改變，評價中藥方劑清胰湯以及姜黃素在SAP大鼠腸道菌群變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 RM2235/2245切片機(jī)、ASP300脫水機(jī)、DM4000B顯微鏡、M4000B圖像采集儀（德國Leica公司）；Qubit?2.0 Fluorometer熒光計和Qubit? dsDNA HS核酸定量分析試劑盒（Invitrogen公司）；96孔磁力架和9700型PCR擴(kuò)增儀（Life Technologies公司）；微型離心機(jī)和電熱恒溫水槽（Eppendorf公司）。清胰湯（柴胡15 g、黃芩10 g、胡連10 g、杭芍15 g、木香10 g、元胡10 g、大黃15 g、芒硝10 g，南開醫(yī)院藥房）；姜黃素（Sigma公司）；高保真DNA聚合酶（KAPA公司，貨號2612）；高敏感度DNA檢測試劑盒（Agilent公司，批號5067-4626）；純化磁珠Agencourt?AMPure XP Beads核酸純化試劑盒（Beckman公司，貨號A63881）；Agilent 2100生物分析儀、SY-410-1003型MiSeq測序儀、MiSeq測序試劑盒v3（貨號MS-102-3003）、MiSeq測序試劑盒v2（貨號MS-102-2003）（Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 SPF級健康Wistar大鼠，雄性，40只，體質(zhì)量（300±10）g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動物實驗中心，許可證號SCXK-（軍）2014-0001。將動物常規(guī)喂食1周后，按照隨機(jī)數(shù)字法分為4組，對照組、模型組、清胰湯組、姜黃素組，每組10只。

1.2.2 動物模型的制備 清胰湯組和姜黃素組分別按體質(zhì)量予10 mL/kg和60 mg/kg中藥湯劑灌胃預(yù)處理，每日1次，連續(xù)7 d。其他組給予等量的0.9%的NaCl溶液。按照文獻(xiàn)［7］的方法，動物實驗前禁食12 h，不禁水。術(shù)前10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，開腹后將模型組、清胰湯組和姜黃素組動物的膽胰管內(nèi)逆行注射5%牛黃膽酸鈉（Na-Fc）1 mL/kg，速率0.05 mL/min，觀察5～10 min后關(guān)腹。對照組僅在開腹后輕輕翻動胰腺幾次，即關(guān)閉腹腔，然后放回鼠籠，常規(guī)喂養(yǎng)，密切關(guān)注其生命體征。

1.2.3 樣本的采集 24 h后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，收集各組樣本的胰腺、腸組織以及盲腸段糞便5～10 g，將組織放入10%福爾馬林溶液中固定，糞便則置于凍存管后，立即放入-80℃保存，待檢測。

1.2.4 蘇木素-伊紅（HE）法染色觀察各組胰腺和腸道的病理變化 各組胰腺、腸組織固定24 h后，脫水、浸蠟、包埋，4μm切片后，脫蠟，蘇木精染色8 min，1%鹽酸乙醇分色，蒸餾水沖洗10 min，0.5%伊紅染色，脫水，中性樹膠封存。各組組織在Leica LAS Extended Annotation模塊的軟件顯微鏡下觀察，其中組織病理評分以chiu’s腸組織損傷評分標(biāo)準(zhǔn)［8］和schmidtt胰腺組織評分標(biāo)準(zhǔn)［9］作為參考。

1.2.5 糞便菌群DNA的抽提與質(zhì)檢以及16S rDNA基因組的測序 參照糞便基因DNA提取試劑盒說明書，抽提所得DNA采用Qubit 2.0和0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢。將質(zhì)檢合格的基因組DNA純化后進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，構(gòu)建樣本測序文庫，Qubit?2.0熒光劑檢測樣本濃度，Agilent 2100檢測文庫的大小，然后按照MiSeq測序試劑說明書，進(jìn)行上機(jī)測序，鑒定腸道菌群組成以及表達(dá)峰度。Chao指數(shù)與ACE指數(shù)為測量菌群的微生物種類即豐富度指標(biāo)，其值越大，物種越豐富；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)為物種多樣性指標(biāo)，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，代表物種越豐富。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 由Illumina提供的數(shù)據(jù)收集軟件（data collection software）進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和實時分析。采用Graphpad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)分析采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腸、胰腺組織中HE染色觀察以及病理評分結(jié)果 與對照組相比，模型組出現(xiàn)腸壁水腫，腸黏膜絨毛變短、缺損、壞死、上皮與固有層分離甚至剝脫，上皮下間質(zhì)之間的腔隙增寬，毛細(xì)血管塌陷，中性粒細(xì)胞明顯浸潤等病理表現(xiàn)，清胰湯、姜黃素組與模型組相比，鏡下可見腸黏膜受損程度均較輕，有部分的腸絨毛缺損以及微血管破裂、出血量也較模型組少，可以基本維持腸組織的完整性。模型組中胰腺組織可見腺泡細(xì)胞明顯腫脹、壞死，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，葉間隙明顯增寬，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管破裂等病理表現(xiàn)，見圖1。清胰湯、姜黃素組與模型組相比，病理評分明顯降低（P＜0.05），見表1。

2.2 糞便中腸道菌群分析

Fig.1 HE staining of the intestinal and pancreatic tissues（×200）圖1 各組腸、胰腺組織的蘇木素-伊紅（HE）染色情況（×200）

Tab.1 The pathologic scores of intestinal and pancreatic tissues表1 各組腸、胰腺組織的病理評分情況 （分，n=10，±s）

Tab.1 The pathologic scores of intestinal and pancreatic tissues表1 各組腸、胰腺組織的病理評分情況 （分，n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表2～5同

組別對照組模型組清胰湯組姜黃素組F腸組織1.32±0.24 4.17±0.28a 3.00±0.33ab 2.78±0.19ab 58.46＊＊胰腺組織0.98±0.17 3.49±0.31a 2.34±0.28ab 2.52±0.29ab 44.58＊＊

2.2.1 可操作單元（OTU）層面 對照組、模型組、清胰湯組、姜黃素組分別有6、8、9、6份樣本。共29份樣本的16S rDNA的V3區(qū)進(jìn)行上機(jī)測序，所有樣本Tags進(jìn)行預(yù)聚類后，在0.03距離即97%的相似度下，得到的OTU值如圖2所示。對照組、模型組、清胰湯組和姜黃素組OTU層面分別為（1 723±39）、（1 978±54）、（2 012±73）和（1 958±105）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.616，P＜0.05）。測序的29個樣本曲線最終基本均趨于平坦，說明測序的樣本量足夠大，具有一定程度的代表性，基本可以反映出測序的絕大多數(shù)菌群物種的生物信息，見圖3。

2.2.2 腸道菌群Alpha多樣性分析 ACE、Chao、Shannon指數(shù)均為清胰湯組＞模型組＞對照組；姜黃素組＞模型組＞對照組，Simpson指數(shù)清胰湯組＜模型組＜對照組；姜黃素組＜模型組＜對照組（均P＜0.05），見表2。

2.2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析 其中的主要優(yōu)勢菌屬（＞1%）。（1）門水平分析：p__Saccharibacteria、p__Proteobacteria（變形菌門）和p__Tenericutes（柔膜菌門）數(shù)量，清胰湯組或姜黃素組與模型組、對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。p__Firmicutes（厚壁菌門）數(shù)量，模型組＞清胰湯組＞對照組；模型組＞姜黃素組＞對照組。p__Bacteroidetes（擬桿菌門）數(shù)量，對照組＞清胰湯組＞模型組；對照組＞姜黃素組＞模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表 3。（2）綱水平分析：c__Deltaproteobacteria（δ變形菌綱）、c__Epsilonproteobacteria（ε-變形菌）數(shù)量，清胰湯組或姜黃素組與模型組、對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。c__Bacilli（芽孢桿菌綱）數(shù)量，模型組＞清胰湯組＞對照組，模型組＞姜黃素組＞對照組；c__Clostridia（梭菌綱）數(shù)量，模型組＞姜黃素組＞對照組；c__Bacteroidia（擬桿菌綱）數(shù)量，對照組＞姜黃素組＞模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），但 c__Clostridia（梭菌綱）、c__Bacteroidia（擬桿菌綱）數(shù)量，清胰湯組與模型組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表4。（3）屬水平分析：g__Desulfovibrio（脫磷孤菌屬）、g__Lactobacillus（乳酸桿菌屬）、g__Ruminiclostridium_9（梭狀芽孢桿菌屬）、g__Helicobacter（螺桿菌屬）、g__Ruminococcaceae_UCG-014（疣微菌屬）、g__Escherichia-Shigella（大腸埃希菌屬）、g__Oscillibacter（顫桿菌克屬）、g__Eubacterium（優(yōu)桿菌屬）數(shù)量，清胰湯組或姜黃素組與模型組、對照組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。g__Lachnos piraceae_NK4A136（毛螺菌屬NK4A136）和g__Bacteroides（擬桿菌屬）數(shù)量，清胰湯與模型組、姜黃素組與模型組以及模型與正常組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表5。

Fig.2 The number of OTUs for all samples圖2 所有樣本的OTUs數(shù)目

Fig.3 Shannon-Wiener curves圖3 香農(nóng)-威納指數(shù)曲線

Tab.2 Comparison of Alpha diversity index between four groups表2 各組Alpha多樣性指數(shù)比較 （±s）

Tab.2 Comparison of Alpha diversity index between four groups表2 各組Alpha多樣性指數(shù)比較 （±s）

組別對照組模型組清胰湯組姜黃素組F n6 8 9 6 ACE 4 973±547 6 147±681a 7 691±1 100ab 7 517±1 184ab 4.041＊Chao 3 322±268 4 079±353a 5 540±641ab 5 112±554ab 4.253＊Shannon 4.41±0.14 5.13±0.15a 5.35±0.14ab 5.29±0.36ab 13.92＊＊Simpson 0.017±0.004 0.028±0.005a 0.013±0.004ab 0.014±0.005ab 3.069＊

3 討論

重癥急性胰腺炎發(fā)病迅速，病情嚴(yán)重，并發(fā)癥多，死亡率高，已成為醫(yī)學(xué)重大難題。人體內(nèi)腸道細(xì)菌有1 000種以上，腸道菌群在機(jī)體營養(yǎng)吸收、抵抗外來病原體的入侵以及維持體內(nèi)微生物環(huán)境方面起著重要的作用。有研究表明，腸道菌群不僅與消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病有關(guān)，與心血管疾病、癌癥、糖尿病、肥胖等也有一定的關(guān)系，因其物種的豐富性以及功能的多樣性，有人稱之為人體的另一個“器官”［10-11］。

厚壁菌門在綱水平可分為梭菌綱、芽孢桿菌綱以及柔膜菌綱，可產(chǎn)生芽孢，有些芽孢具有強(qiáng)致病性，如炭疽芽孢桿菌和肉毒梭菌等，也有些芽孢為有益的梭菌如普拉梭菌。有報道稱，普拉梭菌活菌可以調(diào)控TNF-α、IL-12、IL-10等細(xì)胞因子的分泌以抗炎，另外其產(chǎn)物丁酸還可以為腸黏膜通過非消化道提供能量等［12-13］。優(yōu)勢菌屬擬桿菌門約占人和動物消化道腸道菌群的25%。脆弱擬桿菌具有促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟的功效，在缺乏免疫系統(tǒng)的裸鼠上，注入脆弱擬桿菌后，可通過調(diào)控小鼠的T淋巴細(xì)胞,使其具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的能力［14］。毛螺菌屬于毛螺菌科的主要菌屬，其可觸發(fā)腸道炎癥（即結(jié)腸炎）的發(fā)生，加劇結(jié)腸炎病情［15］。乳酸桿菌屬于大家熟知的益生菌群。清胰湯在臨床上SAP的治療作用已基本得到大家的認(rèn)可［16］。另外有研究表明，清胰湯可通過減少SAP大鼠腸道的菌群移位，有效抑制胃腸道對內(nèi)毒素的吸收作用，從而降低血清中內(nèi)毒素的含量，保護(hù)腸屏障［17］；姜黃素具有抑制SAP大鼠中STAT3 途徑［18］、抑制趨化因子 ENA-78［19］、降低 IL-33、TNF-α、IL-1β和AMY等細(xì)胞因子的分泌等［20］廣泛的藥理作用，減輕炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到對SAP胰腺及其并發(fā)的臟器如肝、腎、腸等損傷的保護(hù)作用，已廣泛應(yīng)用于SAP基礎(chǔ)研究中。

Tab.3 Comparison of the dominant microflora of the phylum between four groups表3 門水平優(yōu)勢菌群屬比較 （±s）

Tab.3 Comparison of the dominant microflora of the phylum between four groups表3 門水平優(yōu)勢菌群屬比較 （±s）

組別對照組模型組清胰湯組姜黃素組F n6 8 9 6 p__Firmicutes 0.324±0.054 0.547±0.064a 0.431±0.054ab 0.439±0.200ab 7.785＊＊p__Bacteroidetes 0.541±0.075 0.359±0.056a 0.399±0.055ab 0.461±0.184ab 5.832＊＊p__Saccharibacteria 0.001±0.051 0.011±0.049 0.018±0.041 0.019±0.031 2.468 p__Proteobacteria 0.056±0.002 0.071±0.003 0.069±0.010 0.067±0.013 0.186 p__Tenericutes 0.029±0.027 0.006±0.001 0.006±0.001 0.005±0.003 1.522

Tab.4 Comparison of the dominant microflora of the class between four groups表4 綱水平優(yōu)勢菌群屬比較 （±s）

Tab.4 Comparison of the dominant microflora of the class between four groups表4 綱水平優(yōu)勢菌群屬比較 （±s）

組別對照組模型組清胰湯組姜黃素組F n6 8 9 6 c__Clostridia 0.311±0.052 0.519±0.057a 0.518±0.064b 0.405±0.197ab 6.548＊＊c__Bacteroidia 0.535±0.077 0.359±0.057a 0.349±0.055b 0.462±0.184ab 5.492＊＊c__Deltaproteobacteria 0.015±0.023 0.028±0.010 0.030±0.010 0.033±0.012 1.956 c__Bacilli 0.008±0.006 0.040±0.026a 0.025±0.027ab 0.025±0.011ab 5.905＊＊c__Epsilonproteobacteria 0.030±0.031 0.018±0.014 0.009±0.007 0.017±0.018 1.506

Tab.5 Comparison of the dominant microflora of the genus between four groups表5 屬水平優(yōu)勢菌群屬比較 （±s）

Tab.5 Comparison of the dominant microflora of the genus between four groups表5 屬水平優(yōu)勢菌群屬比較 （±s）

組別對照組模型組清胰湯組姜黃素組F n6 8 9 6 g__Lachnospiraceae_NK4A136 0.116±0.029 0.158±0.023a 0.054±0.054b 0.123±0.065ab 6.219＊＊g__Bacteroides 0.089±0.037 0.013±0.003a 0.025±0.014b 0.027±0.012ab 21.080＊＊g__Desulfovibrio 0.033±0.022 0.029±0.010 0.014±0.011 0.027±0.012 2.006 g__Lactobacillus 0.039±0.006 0.008±0.026 0.025±0.027 0.025±0.011 2.411 g__Ruminiclostridium_9 0.025±0.003 0.019±0.006 0.011±0.007 0.025±0.025 1.724組別對照組模型組清胰湯組姜黃素組F n6 8 9 6 g__Helicobacter 0.017±0.032 0.009±0.014 0.030±0.007 0.018±0.018 1.506 g__Ruminococcaceae_UCG-014 0.012±0.002 0.019±0.006 0.014±0.009 0.021±0.007 2.288 g__Escherichia-Shigella 0.014±0.002 0.018±0.041 0.004±0.033 0.023±0.018 0.482 g__Oscillibacter 0.013±0.006 0.014±0.009 0.010±0.009 0.023±0.008 2.843 g__Eubacterium 0.014±0.004 0.019±0.004 0.006±0.012 0.012±0.011 2.141

大鼠發(fā)生SAP時，正常腸道黏膜屏障破壞、腸道菌群失調(diào)，為腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位提供了通道，內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)，刺激吞噬細(xì)胞釋放大量的炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)，可誘發(fā)膿毒血癥和多臟器功能衰竭的發(fā)生［21］。本實驗中，從對大鼠胰腺、結(jié)腸組織的HE染色、病理評分可知，SAP大鼠的腸道黏膜屏障發(fā)生嚴(yán)重的破壞，出現(xiàn)明顯的腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象，若實驗前給予大鼠中藥清胰湯和姜黃素預(yù)處理1周后，可使大鼠腸黏膜和胰腺病理受損程度較SAP模型組減輕，說明用牛黃膽酸鈉造模SAP大鼠成功。通過糞便的16S rDNA測序可知，清胰湯或（和）姜黃素組可有效降低SAP大鼠厚壁菌門（包括梭菌綱、芽孢桿菌綱）、毛螺菌屬數(shù)量菌群含量，升高擬桿菌門（包括擬桿菌綱、擬桿菌屬）和乳酸桿菌屬含量。綜上所述，從功效方面，中藥清胰湯和姜黃素具有改善重癥急性胰腺炎胰腺組織損傷的功效，對保護(hù)腸黏膜屏障有一定的作用。從微生態(tài)方面，中藥清胰湯和姜黃素可增加SAP大鼠的腸道菌群的多樣性和豐富性，調(diào)控微生物生態(tài)平衡，增加益生菌群的含量，降低有害菌群的定植能力，從而達(dá)到對腸道的保護(hù)作用。但微生物菌群的綱、門、科、屬、種分類后，種類較多，本實驗僅從優(yōu)勢菌屬中探討各實驗組中微生態(tài)變化，還不夠全面，仍需要進(jìn)一步更全面的、更深入的研究其他的變化。