仿生圓周取向微米纖維支架構(gòu)建組織工程椎間盤纖維環(huán)

杜立龍，徐寶山，楊強(qiáng)，程招軍，許海委

退行性椎間盤疾病的發(fā)病率和致殘率較高，給患者的工作和生活帶來了極大的不便，也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。尤其是椎間盤退變引起的椎間盤突出癥，癥狀嚴(yán)重且保守治療無效，往往需要手術(shù)治療。椎間盤髓核摘除術(shù)是治療椎間盤突出癥最常用的外科手術(shù)方式。雖然手術(shù)治療可有效緩解疼痛和改善功能，但仍有5%～20%的患者術(shù)后復(fù)發(fā)［2］。其主要原因是髓核摘除術(shù)后遺留纖維環(huán)部分缺損，而纖維環(huán)自我修復(fù)能力有限，破裂缺損的椎間盤進(jìn)一步退變，導(dǎo)致突出復(fù)發(fā)，引起慢性腰腿痛和功能障礙，嚴(yán)重者需再次手術(shù)。因此，修復(fù)纖維環(huán)破裂缺損是一個亟待解決的問題。

當(dāng)前，國內(nèi)外學(xué)者嘗試了多種修復(fù)破裂缺損纖維環(huán)的方法，如纖維環(huán)縫合、特制的纖維環(huán)修補(bǔ)裝置等［3］。這些方法主要是傳統(tǒng)的外科修補(bǔ)策略，均未能恢復(fù)纖維環(huán)的生物學(xué)功能，遠(yuǎn)期效果不理想，迫切需要探索新的治療措施［4］。椎間盤組織工程技術(shù)為纖維環(huán)的再生修復(fù)提供了新的治療策略。以往的組織工程纖維環(huán)支架結(jié)構(gòu)多是三維蜂窩狀多孔狀或是無規(guī)則的纖維，未能模擬天然纖維環(huán)的圓周取向結(jié)構(gòu)［5］。本研究通過濕法紡絲技術(shù)制備仿生圓周取向的微米纖維支架，接種兔纖維環(huán)細(xì)胞，在體外構(gòu)建組織工程化纖維環(huán)，旨在探討其作為仿生組織工程化纖維環(huán)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 新鮮椎間盤組織取自于體質(zhì)量約2 kg的雌性新西蘭大白兔（4只，由天津醫(yī)院動物實驗室提供），用于兔纖維環(huán)細(xì)胞提取，相關(guān)動物實驗方案已獲天津醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）、鬼筆環(huán)肽、番紅O染料、DAPI、DiI、免疫熒光抗體（Sigma公司，美國）；Live/dead染色試劑（Invitrogen，美國）；Ⅰ型膠原抗體（Abcam，美國）；羊抗兔IgG二抗（Santa Cruz Biotechnology，美國）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi，日本）；Micro-CT（西門子，德國）。

1.2 仿生圓周取向PCL微米纖維支架的制備 將PCL顆粒溶解在CHCl3/THF（3∶1，v/v）中獲得10%（w/v）PCL溶液。然后將上述PCL紡絲原液置入10 mL注射器中，通過注射泵以恒定速度（1 mL/h），經(jīng)10 mL注射器、5號針頭注射到300 mL食用油和100 mL正己烷的混合溶液中，控制磁子攪拌速率，調(diào)節(jié)接收器與針頭出口間的距離，使纖維能夠從針頭中穩(wěn)定抽出并持續(xù)取向纏繞在3 mm直徑的接收轉(zhuǎn)軸上（圖1A）；在擠出所需體積的PCL溶液后，從轉(zhuǎn)軸上取出收集的纖維（圖1B），正己烷洗滌除去油漬，并在真空干燥器中抽吸2 d以除去殘留的試劑。用手術(shù)刀片裁成2 mm厚，獲得外徑6 mm、內(nèi)徑3 mm、高2 mm的三維仿生纖維環(huán)支架（圖1C）。

1.3 圓周取向支架理化性能表征 （1）大體觀察。用體式顯微鏡觀察圓盤狀支架的大體形態(tài)及結(jié)構(gòu)。（2）Micro-CT三維成像分析。參照Vanlenthe［6］的方法，樣品在3%的鋨酸中4℃浸泡過夜后凍干，置于Micro-CT下進(jìn)行三維成像分析。（3）掃描電子顯微鏡（SEM）觀察。通過SEM分別對噴金后支架的橫切面和縱斷面的纖維形貌特征進(jìn)行觀察。（4）支架纖維直徑測量。通過Image J軟件分析支架纖維的掃描電子顯微鏡（500倍）圖像，并通過測量超過50根纖維的直徑來測算PCL支架的纖維直徑。（5）支架孔隙率測定。參照Wang等［7］的方法，用質(zhì)量體積法測量孔隙率，將支架切成形狀大小規(guī)則的樣品，游標(biāo)卡尺測量樣品尺寸，計算樣品體積。每組3個樣品，稱量樣品質(zhì)量，每個樣品測量3次。公式如下：孔隙率=［1-（m/V×ρ）］×100%。其中：m為PCL支架的質(zhì)量，V為支架的表觀體積，ρ為PCL材料的密度ρ=1.145 g/cm3。

1.4 組織工程椎間盤纖維環(huán)的構(gòu)建 （1）分離培養(yǎng)兔纖維環(huán)細(xì)胞。大白兔用CO2處死后，即刻對背部皮膚消毒。背部正中切口，暴露脊柱，取胸10至腰5節(jié)段，切取完整的椎間盤，分離纖維環(huán)組織，置于平皿中，用Hank’s緩沖液漂洗3遍后剪碎成約1 mm3均勻的組織塊。隨后加入0.2%Ⅱ型膠原酶，在37℃下消化2～3 h，過濾掉未消化的組織，1 000 r/min離心10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將所得的細(xì)胞沉淀重懸，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)待用。（2）支架預(yù)處理。支架經(jīng)60Co射線輻照滅菌后，浸泡于DMEM培養(yǎng)基中過夜，以待接種細(xì)胞。（3）細(xì)胞接種。用無菌濾紙將上述浸泡待用支架中的培養(yǎng)基吸干，置于24孔培養(yǎng)板中，用微量移液器吸取40μL P2代纖維環(huán)細(xì)胞懸液（密度1×107/mL），均勻接種到支架表面后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 h，使細(xì)胞在支架材料上完全黏附、鋪展（圖1D）。隨后，加入2～3 mL新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)14 d，每天更換培養(yǎng)基。

Fig.1 The schematic illustration of fabrication of the biomimetic circumferentially oriented microfiber scaffold and the AF-scaffold composite圖1 仿生圓周環(huán)形取向性PCL微米纖維環(huán)支架的制備流程及組織工程纖維環(huán)的構(gòu)建

1.5 纖維環(huán)細(xì)胞在支架中的行為評估 （1）SEM觀察。將培養(yǎng)14 d后的支架復(fù)合物浸泡于2.5%戊二醛中固定過夜，使用梯度乙醇逐級脫水，干燥后表面噴金，用SEM對細(xì)胞在支架表面的黏附鋪展情況進(jìn)行觀察。（2）Live/dead染色觀察。培養(yǎng)14 d后，吸出培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞-支架復(fù)合物2次，加入配置好的Live/dead染液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min后，使用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞活（綠）死（紅）情況進(jìn)行觀察。（3）羅丹明-鬼筆環(huán)肽（Rhodamine-phalloidin）染色。使用4%多聚甲醛固定培養(yǎng)14 d后的細(xì)胞支架復(fù)合物20 min，0.1%tritonX-100/PBS破膜；然后加入200μL羅丹明-鬼筆環(huán)肽溶液（2.5 mg/L）對細(xì)胞骨架進(jìn)行染色，避光孵育1 h；PBS漂洗5次后，加入200μL DAPI溶液，復(fù)染細(xì)胞核，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架伸展形態(tài)。（4）細(xì)胞遷移情況評估。在體外無菌條件下，用2.5 mmol/L DiI（細(xì)胞膜紅色熒光探針）對纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后按1.2（3）步驟接種到支架上；培養(yǎng)14 d后，使用冷凍切片機(jī)對樣品進(jìn)行切片（橫向和縱向），樣品置于熒光顯微鏡下，觀察細(xì)胞遷移情況。

1.6 組織學(xué)分析 （1）H&E染色和番紅-O染色。將培養(yǎng)14 d后的細(xì)胞-支架復(fù)合物置于4%多聚甲醛中固定1 h，脫水浸蠟后，使用石蠟包埋機(jī)包埋，切成6μm厚的樣品片。對樣品片常規(guī)脫蠟復(fù)水后，行H&E染色和番紅-O染色，分別觀察纖維環(huán)細(xì)胞分布及蛋白多糖分泌情況。（2）Ⅰ型膠原免疫組化和免疫熒光染色。將石蠟組織切片脫蠟處理后，在3%H2O2溶液中處理10 min，含5%牛血清白蛋白37℃孵育30 min，后加入一抗（兔抗Ⅰ型膠原蛋白抗體），4℃過夜，洗滌后與生物素化的羊抗兔IgG二抗置于濕盒中4℃冰箱孵育過夜，用DAB顯色處理，顯微鏡下觀察。免疫熒光染色采用Alexa Fluor 488標(biāo)記親和山羊抗兔IgG二抗，其余步驟不變。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 由體式顯微鏡觀察可知，通過濕法紡絲技術(shù)所制備的PCL纖維環(huán)支架呈圓盤狀，具有類似于天然纖維環(huán)的外形結(jié)構(gòu)；微米纖維圓周分布，壁厚（2 mm）均勻，測內(nèi)徑約為2 mm，外徑6 mm。見圖2A～C。

2.2 Micro-CT成像和掃描電鏡觀察 Micro-CT三維成像顯示整個纖維環(huán)支架呈3D環(huán)狀取向結(jié)構(gòu)，且纖維之間存在均勻的空隙，見圖2D。SEM結(jié)果表明，整個PCL纖維環(huán)支架呈圓周取向結(jié)構(gòu)，纖維形狀為規(guī)則的圓柱形，直徑均勻，呈現(xiàn)取向性分布，纖維之間無粘連，見圖2E～H。

2.3 支架孔隙率、纖維直徑測定 經(jīng)測算支架的孔隙率為69.33%±6.67%，纖維直徑為（16.13±2.77）μm。

2.4 細(xì)胞行為分析 （1）SEM觀察可見，細(xì)胞在支架上接種14 d后呈長梭形并沿纖維方向鋪展，周圍有細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分泌，見圖3A。（2）Live/dead染色顯示，細(xì)胞在支架上培養(yǎng)14 d后仍具較高的存活率，基本無死細(xì)胞（紅），而且還呈現(xiàn)取向性生長的趨勢，見圖3B。（3）鬼筆環(huán)肽染色顯示，支架上的纖維環(huán)細(xì)胞的細(xì)胞肌絲均沿PCL纖維取向方向伸展，見圖3C。（4）體外培養(yǎng)14 d后，樣品縱切面顯示DiI熒光標(biāo)記的細(xì)胞遷移滲透到整個支架內(nèi)部，見圖3D。

2.5 組織學(xué)分析 H&E染色可見，培養(yǎng)后的細(xì)胞呈長梭形，能夠沿著微米纖維取向均勻地黏附鋪展在支架表面及內(nèi)部，見圖4A；番紅O染色（圖4B）、Ⅰ型膠原免疫組化和免疫熒光染色可見纖維環(huán)胞漿和細(xì)胞外周有大量ECM，并且沿微米纖維取向性分布，見圖4C～F；DAPI染色可見細(xì)胞核呈紡錘形沿微米纖維伸長，見圖4E。

3 討論

Fig.2 The structures of the biomimetic circumferentially oriented microfiber scaffold圖2 仿生圓周取向性纖維環(huán)支架的結(jié)構(gòu)觀察

Fig.3 Evaluation of the cell behaviors inside the scaffold圖3 組織工程纖維環(huán)中纖維環(huán)細(xì)胞的行為評價

3.1 組織工程椎間盤纖維環(huán)支架的特點(diǎn) 椎間盤纖維環(huán)由10～25層同心膠原纖維排列而成［8］。成功的組織工程纖維環(huán)支架應(yīng)當(dāng)模擬天然纖維環(huán)的微觀結(jié)構(gòu)［9］。早期纖維環(huán)支架多為相互連通的多孔蜂窩狀結(jié)構(gòu)［10-11］，其不具有仿生結(jié)構(gòu)；也有研究者采用天然脫細(xì)胞多孔支架材料，如脫鈣脫細(xì)胞骨基質(zhì)環(huán)等［12］，但存在免疫原性及可能傳播疾病的缺陷。近年來，許多研究者模擬上述天然纖維環(huán)的取向纖維結(jié)構(gòu)，而不局限于單相的多孔均一結(jié)構(gòu)或無規(guī)則纖維結(jié)構(gòu)。靜電紡絲技術(shù)在制備取向纖維支架方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，是目前制備纖維環(huán)支架的常用方法［15］。如 Koepsell等［14］利用靜電紡絲技術(shù)，以 PCL為材料制備納米纖維膜，并復(fù)合AF細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程纖維環(huán)；Zhu等［16］發(fā)現(xiàn)纖維環(huán)來源的干細(xì)胞能在取向性靜電紡絲聚醚碳酸酯纖維上定向生長，比在無規(guī)則纖維上分泌更多的Ⅰ型膠原和聚集蛋白聚糖。然而傳統(tǒng)的靜電紡絲納米纖維支架是由緊密堆積的納米纖維組裝而成，其僅僅提供了細(xì)胞生長的表面結(jié)構(gòu)，而限制細(xì)胞遷移滲透入支架內(nèi)部，這是靜電紡絲支架的一個不可避免的限制因素。因此，制備兼具有高孔隙率高，并能促進(jìn)細(xì)胞生長遷移的三維取向纖維環(huán)支架仍是一個挑戰(zhàn)。

濕紡成形技術(shù)是一種新型濕法擠出工藝，可制備自組裝的非編制微米纖維支架，目前已應(yīng)用于神經(jīng)、肌腱、肌肉等組織修復(fù)［17］。濕紡成形系統(tǒng)中，筆者采用溶劑去除技術(shù)，通過將紡絲持續(xù)滴入聚合物（PCL）的非溶劑浴中（食用油∶正己烷=3∶1），PCL中三氯甲烷溶劑與非溶劑立即進(jìn)行逆擴(kuò)散，使得PCL在非溶劑浴析出成形，并在勻速旋轉(zhuǎn)的液體剪切力作用下形成纖維，通過不銹鋼棒收集組裝纖維，獲得環(huán)形纖維支架［17-18］。本研究中，筆者采用濕法紡絲方法，通過調(diào)節(jié)紡絲原液的濃度、流出速度及針頭大小來控制纖維的粗細(xì)，可獲得直徑介于幾微米到幾百微米的纖維；并且可通過調(diào)節(jié)收集速度、非溶劑比例調(diào)節(jié)直徑的孔隙率和連通度。同時，本研究選用FDA批準(zhǔn)的PCL材料，其具有優(yōu)越的力學(xué)性能和良好的生物相容性，是制備纖維環(huán)支架的優(yōu)越材料。采用搭建的濕紡成形系統(tǒng)成功制備了圓周取向的微米纖維環(huán)支架。體式顯微鏡、SEM及micro-CT觀察結(jié)果顯示支架為三維圓周取向的圓環(huán)結(jié)構(gòu)，支架內(nèi)部的PCL纖維定向分布，纖維之間無粘連，纖維直徑規(guī)則、均勻，約（16.13±2.77）μm。另外，支架的孔隙率達(dá)69.33%±6.67%，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易分層，是構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的有效支架。

Fig.4 The histology and immunohistochemistry analyses of the cell-scaffold composite圖4 組織工程纖維環(huán)組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色

3.2 PCL微米纖維支架對細(xì)胞行為的影響 理想的組織工程纖維環(huán)支架需為種子細(xì)胞提供擬天然的空間和微環(huán)境［5］。以往有研究證實定向纖維可引導(dǎo)細(xì)胞肌絲沿纖維鋪展生長。諸多研究證實了無規(guī)則纖維和定向纖維對種子細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)在長梭形細(xì)胞的比例遠(yuǎn)高于無規(guī)則纖維［19］。與之相同，本研究中將兔AF細(xì)胞接種于構(gòu)建的仿生纖維環(huán)支架上，SEM和細(xì)胞肌絲染色分析顯示AF細(xì)胞沿定向的PCL纖維生長分布。這可能由于AF細(xì)胞肌絲感應(yīng)黏附基質(zhì)形態(tài)，兩者相互作用，引起細(xì)胞黏附斑構(gòu)型變化，進(jìn)而引起細(xì)胞傳遞形態(tài)變化，表現(xiàn)出與微米纖維方向一致的長梭形［20］。另外，Live/dead染色顯示AF細(xì)胞在支架上表現(xiàn)出良好的生長活性，表明支架無細(xì)胞毒性作用，也呈現(xiàn)沿纖維取向生長的趨勢。我們觀察到DiI細(xì)胞膜熒光標(biāo)記的細(xì)胞接種到支架14 d后，AF細(xì)胞可完全遷移長入整個支架內(nèi)部；而在靜電紡絲支架中，種子細(xì)胞則難以長入，僅局限于支架表面［19］。其原因主要是與靜電紡絲支架相比，濕紡紡絲制備的纖維支架孔徑大、結(jié)構(gòu)疏松，為細(xì)胞的生長、增殖和遷移提供了合適的空間，并有利于細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物的交換，這也是構(gòu)建三維組織工程化纖維環(huán)的難點(diǎn)。

3.3 組織工程纖維環(huán)的再生重塑 仿生支架結(jié)構(gòu)可通過引導(dǎo)種子細(xì)胞擬天然生長進(jìn)而促進(jìn)纖維環(huán)組織的再生重塑［21］。組織學(xué)染色顯示，纖維環(huán)細(xì)胞及其分泌的ECM均在微米纖維支架上取向性生長和分布，其原因是由于細(xì)胞形態(tài)的改變引起的分泌ECM結(jié)構(gòu)的改變，以及支架的空間取向孔隙結(jié)構(gòu)對于ECM的引導(dǎo)作用。在本研究中組織學(xué)評估發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原免疫組化和免疫熒光染色陽性，提示大量Ⅰ型膠原蛋白沉積，這也是天然纖維環(huán)的主要膠原成分。同時本研究也證實了椎間盤AF細(xì)胞具有分泌和沉積與天然纖維環(huán)組織相似組成和結(jié)構(gòu)的ECM組織的能力。這種仿生支架取向引導(dǎo)細(xì)胞和重塑再生ECM的作用對于椎間盤纖維環(huán)的再生修復(fù)是至關(guān)重要的，尤其是在椎間盤原位修復(fù)微環(huán)境中的組織功能重建和整合。

綜上所述，濕紡成形法制備仿生圓周取向的PCL纖維環(huán)支架具有合適的孔徑、較高的孔隙率和良好細(xì)胞相容性；其有利于AF細(xì)胞的遷移滲透，并能夠引導(dǎo)AF細(xì)胞取向性生長和ECM的擬天然再生重塑，是構(gòu)建組織工程纖維環(huán)的理想支架載體，有望用于破裂退變纖維環(huán)的再生修復(fù)。