清胰湯通過lncRNA-PVT1競爭性結(jié)合miR-146a靶向TRAF6參與重癥胰腺炎發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

賴紀(jì)英 盧涵婧 郭宗文 岳霖琳 劉 欣 劉曉峰

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，江西 贛州 341000）

重癥胰腺炎又稱為出血壞死性胰腺炎，不僅能引起腹腔大出血、腸瘺，亦可引起多器官功能衰竭[1]。作為臨床上常見的急腹癥，死亡率能達(dá)到20.0%～40.0%，具有病情重、預(yù)后差等特點，為我國居民死亡的重要原因[2]。項紅等[3]研究表明急性重癥胰腺炎患者早期死亡高峰為1～2周左右，多數(shù)患者死于全身炎癥反應(yīng)引起的多器官功能障礙綜合征。目前，急性重癥胰腺炎的確切分子機(jī)制尚未闡明，既往研究顯示腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）能促進(jìn)急性重癥胰腺炎所致的炎癥反應(yīng)。因此，以此為靶點開發(fā)急性胰腺炎的治療藥物，具有很大的臨床價值。miR-146a是一種主要在免疫炎癥反應(yīng)中起調(diào)控作用的微小核糖核酸（microRNA-146a，miR-146a）。Eliana Rodríguez等[4]研究表明miR-146a能夠下調(diào)靶基因TRAF6的表達(dá)，通過某些信號通路起到抑制炎癥反應(yīng)作用，從而抑制急性重癥胰腺炎的病理過程。miR-146a能抑制靶基因TRAF6，且除了TRAF6外，尚存在一個未知的靶基因，對相關(guān)信號通路發(fā)揮抑制作用，miR-146a可能通過對TRF6與其他靶基因共同調(diào)節(jié)來調(diào)控相應(yīng)的炎癥信號通路。漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1（PVT1）是首個報道與腫瘤相關(guān)的長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA），lncRNA PVT1是一個原癌“基因”。史玉潔等[5]研究表明：清胰湯用于急性重癥胰腺炎患者中具有良好的效果，能下調(diào)lncRNA PVT1表達(dá)水平，促進(jìn)miR-146a的表達(dá)，下調(diào)TRAF6的表達(dá)水平抑制炎癥反應(yīng)，延緩病情進(jìn)展，為患者后續(xù)治療奠定基礎(chǔ)。在哮喘相關(guān)炎癥中也證實了lncRNA PVT1通過靶向miR-423基因抑制炎癥反應(yīng)[6]。因此，本研究主要探討清胰湯在重癥胰腺炎患者抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動物資料 購置SD大鼠50只，隨機(jī)取10只設(shè)為空白對照組；剩余40只大鼠采用4%牛黃膽酸鈉注射制備重癥胰腺炎動物模型，建模成功后隨機(jī)取10只為模型對照組；剩余30只大鼠分為清胰湯組、清胰湯+空載組（空白腺病毒轉(zhuǎn)染的空白載體組簡稱空載組）和清胰湯+PVT1沉默組，每組各10只。50只SD大鼠，雌雄隨機(jī)，體質(zhì)量（200～220）g，平均（210.00±10.00）g。所選動物均購置于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗部。將購置的大鼠于動物房7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)，安靜環(huán)境飼養(yǎng)，室溫（22±2）℃，12 h交替光照，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.2 儀器與設(shè)備 生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，型號：BL-420，購自于成都泰盟公司；電子分析天平，購自于德國賽多利斯公司；超低溫冰箱，購自于中國海爾公司；酶標(biāo)儀，購自于美國BioTek公司；37℃恒溫箱，購自于上海實驗儀器廠；石蠟包埋機(jī)，購自于湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡，購自于日本Olympus公司；電泳裝置，型號：DYCP-31BM，購自于北京市六一儀器廠；凝膠成像及分析系統(tǒng)，型號：LabWorks TM，購自于美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 建模方法 30只SD大鼠參與重癥胰腺炎模型建立，建模前均常規(guī)禁食24 h，禁飲4 h，給予濃度為10.0%水合氯醛（0.3 ml/100g）腹腔內(nèi)注射麻醉。常規(guī)進(jìn)行腹部剪毛，絡(luò)合碘消毒后，鋪無菌孔巾。待上述操作完畢后，在上腹正中線作長為3 cm的手術(shù)切口，并將切口下皮膚與肌層分離，打通切口到頸背部皮下隧道，逐層分離后進(jìn)入腹腔。肉眼直視下確定十二指腸及胰腺部位，采用1號針頭在胰膽管兩側(cè)斜行穿刺進(jìn)入十二指腸弓兩層腹膜之間潛在的間隙。給予濃度為5%牛磺酸膽堿，每100 g體質(zhì)量0.1 ml，于3～5 min內(nèi)注射完畢，輕輕按摩約15 s，保證藥物的均勻彌散，使得胰腺區(qū)彌漫性充血、膨脹。

1.3.2 慢病毒注射及處理方法

（1）慢病毒注射。攜帶shPVT1慢病毒（LVshPTV1，5×108TU/ml）及空載病毒（LV-Control，8×108TU/ml），購自于吉凱基因。于建模前2周，常規(guī)采用立體定位儀，采用微量加樣器將慢病毒注入SD大鼠右側(cè)結(jié)腸兩個位點：位點1：A-P1.0 mm，M-L-2.0 mm，D-V-1.2 mm；位點2：A-P-3.0 mm，M-L-1.5 mm，D-V-1.2 mm，每個位點注射2.5 μL?？刂坡《咀⑸渌俣葹?.5 μL/ml，拔針前原位停留5 min。

（2）大鼠處理方法。清胰湯組成：柴胡15 g、白芍15 g、黃芩10 g、木香10 g、黃連10 g，加水500 ml，瓦罐內(nèi)文火熬制1h，濾渣，余液繼續(xù)文火熬煮濃縮到85 ml，置入生大黃15 g后，沖入芒硝10 g，常規(guī)制備生藥/溶液1∶1的成藥制劑，使用前將其放置在5℃冰箱中，保存。利用慢病毒轉(zhuǎn)染干擾lncRNA PVT1序列（LV-shPVT1）及空載（LV-control），分為清胰湯組、清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組，每日用藥1次，連續(xù)干預(yù)7 d[7-8]。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）HE染色。各組大鼠干預(yù)7 d后，斷頸方式處死，取胰腺組織，經(jīng)石蠟包埋后制備4 μm切片，并完成HE染色[9]。

（2）炎癥因子。各組大鼠干預(yù)7 d后，以斷頸方式處死，取靜脈血5 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）水平；采用實時熒光PCR法測定各組miR-146a水平。

（3）TRAF6及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)。采用Western blot法測定各組TRAF6及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因（包括β-actin、ki-67、Bax、caspase、Caspase-9）表達(dá)，采用BiO-R重癥胰腺炎圖像分析系統(tǒng)照相，并利用Quantity One v4.6.2軟件分析[10]。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 26.0軟件處理，計數(shù)資料行χ2檢驗，采用n（%）表示；多組計量數(shù)據(jù)比較采用F檢驗，兩組間計量資料行t檢驗，采用±s表示，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胰腺組織HE染色結(jié)果比較 HE染色結(jié)果表明，清胰湯組病理學(xué)改善顯著，胰腺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕；清胰湯+空載組和模型組胰腺組織內(nèi)可見微血栓形成，且隨著時間延長加重，炎癥細(xì)胞浸潤明顯，伴有上皮細(xì)胞炎性浸潤；而清胰湯+PVT1沉默組則介于清胰湯組和清胰湯+空載組之間，見圖1。

圖1 各組小鼠胰腺組織HE染色

2.2 各組炎癥因子及miR-146a表達(dá)水平比較 清胰湯組TNF-α、IL-1β表達(dá)水平均低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；miR-146a表達(dá)水平高于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）。清胰湯+空載組TNF-α、IL-1β水平高于和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05），miR-146a水平低于清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組TRAF6及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較 清胰湯組TRAF6表達(dá)水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；細(xì)胞凋亡相關(guān)基因β-actin、ki-67、Bax、caspase-3、Caspase-9表達(dá)水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；清胰湯+PVT1沉默組以上指標(biāo)表達(dá)水平低于清胰湯+空載組（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組TRAF6及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較

3 討論

重癥急性胰腺炎起病急驟、病情兇險、合并癥多、死亡率較高，且臨床治療復(fù)雜、住院時間長，醫(yī)療費用較高，增加家庭及社會負(fù)擔(dān)[11]。Wang C等[12]研究表明：重癥急性胰腺炎患者常伴有胃腸動力障礙，增加麻痹性腸梗阻、腹腔間隔室綜合征及腸道菌群移位等并發(fā)癥發(fā)生率。但是，臨床上對于重癥急性胰腺炎患者的分子機(jī)制尚未闡明。TRAF6能顯著促進(jìn)急性重癥胰腺炎所致的炎癥反應(yīng)，以此為靶點開發(fā)急性重癥胰腺炎的治療藥物據(jù)有很大的臨床價值。本研究中，HE染色結(jié)果表明，清胰湯組病理學(xué)改善顯著，胰腺組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤減輕明顯；清胰湯+空載組和模型組可見微血栓形成，且隨著時間延長加重，炎性細(xì)胞浸潤明顯，伴有上皮細(xì)胞炎性浸潤。本研究中，重癥胰腺炎大鼠建模成功后，伴有病理學(xué)的改變，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞的大量浸潤。而清胰湯的使用，能改善重癥急性胰腺炎大鼠癥狀，能降低機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。分析原因清胰湯屬于中醫(yī)常用湯藥，主要由柴胡、白芍、黃芩、木香、黃連等藥物組成。方藥中，柴胡具有解表退熱、疏肝解郁功效；白芍能發(fā)揮斂陰止汗、柔肝止痛功效；黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒功效；木香能發(fā)揮疏理肝氣、行氣止痛作用；黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒功效；諸藥共奏，能促進(jìn)胃腸蠕動，降低腸腔內(nèi)壓力，保護(hù)腸黏膜屏障，抑制菌群移位[13]。本研究中，清胰湯組TNF-α、IL-1β水平均低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05），而miR-146a水平高于其他組，這提示清胰湯能降低重癥急性胰腺炎大鼠炎癥反應(yīng)。

本研究通過生物信息學(xué)軟件Starbase V2.0篩選出與TRAF6存在結(jié)合位點的miR-146a，二者呈現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)，在急性重癥胰腺炎患者可通過提高miR-146a的表達(dá)，的靶向下調(diào)TRAF6，抑制炎癥反應(yīng)，抑制急性重癥胰腺炎的病理進(jìn)程。同時，通過生物信息軟件Starbase V2.0分析篩選出能夠在急性胰腺炎組織中高表達(dá)，且與miR-146a啟動子3'-UTR區(qū)域存在明顯結(jié)合位點的lncRNA PVT1。而清胰湯的使用能下調(diào)lncRNA PVT1的表達(dá)，上調(diào)miR-146a的表達(dá)水平，通過對TRAF6的抑制等多個通路抑制炎癥反應(yīng)，減緩急性重癥胰腺炎的發(fā)生發(fā)展[14]。本研究中，清胰湯組TRAF6表達(dá)水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；細(xì)胞凋亡相關(guān)基因β-actin、ki-67、Bax、caspase、Caspase-9表達(dá)水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05），這提示清胰湯的使用能下調(diào)lncRNA PVT1表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，延緩病情發(fā)展。明確相關(guān)的作用機(jī)制可為重癥急性胰腺炎的治療提供新的思路。

綜上所述，在重癥胰腺炎中，清胰湯能通顯著下調(diào)lncRNA-PVT1表達(dá)，上調(diào)miR-146a的表達(dá)水平，通過靶向抑制TRAF6等相關(guān)通路，抑制炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，減緩重癥胰腺炎的病理進(jìn)展，改善患者預(yù)后。