星點設(shè)計—響應(yīng)面法優(yōu)選五味子的二次提取工藝

葉殷殷 李巖 李子行 曹智啟

[摘要]目的 分別采取星點設(shè)計-響應(yīng)面法對五味子的兩次提取工藝進行優(yōu)選。方法 采用UV法于278 nm波長處測定木脂素含量，以木脂素含量為因變量，乙醇濃度、提取時間和溶劑倍量為自變量，采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法依次優(yōu)選五味子2次提取工藝。結(jié)果 第一次提取的最佳提取工藝為：10倍藥材量的70%乙醇回流提取五味子70 min，二項式擬合復相關(guān)系數(shù)為r=0.8900，提取率實際值比預測值大；第二次提取以10倍藥材量的70%乙醇回流提取五味子40 min，二項式擬合復相關(guān)系數(shù)為r=0.8445，驗證試驗所得木脂素平均值為8.953 mg/g，真實值與預測值偏差為2.0%。結(jié)論 分次進行星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)選所得的五味子提取工藝預測性好，縮短了提取的時間，降低生產(chǎn)成本。

[關(guān)鍵詞]星點設(shè)計-響應(yīng)面法；二次提??；木脂素；五味子醇甲

[中圖分類號] R283.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）8（b）-0008-05

Optimization of the secondary reflux extraction process of Schisandrae Chinensis Fructus by central composite design-response surface methodology

YE Yin-yin LI Yan LI Zi-hang CAO Zhi-qi

Lingnan Institute of Technology， Guangdong Province， Guangzhou 510663， China

[Abstract] Objective To optimize secondary extraction processes of Schisandrae Chinensis Fructus through the central composite design-response surface methodology. Methods The content of lignan was determined by Ultraviolet spectrophotometry at the wavelength of 278 nm. The content of lignin as dependent variable， ethanol concentration， extraction time and solvent times as independent variables， the secondary extraction processes of Schisandrae Chinensis Fructus was optimized by central composite design-response surface methodology. Results The first extraction process was optimized as follow： extracted Schisandrae Chinensis Fructus for 70 min with 10 times， the amount of crude drugs and the volumes of 70% ethanol. The binomial fitting complex correlation coefficient was r=0.8900， and the actual value of extraction ratio was larger than the predicted. The second extraction process was optimized as follow： extracted Schisandrae Chinensis Fructus for 40 min with 10 times the amount of crude drugs and the volumes of 70% ethanol. The correlation coefficient of binomial fitting was r=0.8445. The average value of lignans obtained from the verification test was 8.953 mg/g， and the deviation between the true value and the predicted value was 2.0%. Conclusion The central composite design-response surface methodology is preferred， and the obtained Schisandra extraction process has good predictability， shortens the extraction time， and reduces the production cost.

[Key words] Central composite design-response surface methodology； Secondary extraction； Lignin； Schizandrin

五味子是一種木蘭科植物，具有性溫、甘及味酸等特點，歸肺、腎、心經(jīng)，能夠發(fā)揮出收斂固澀、益氣生津、補腎寧心等功效，臨床用于治療久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心悸失眠[1]。其主要的有效成分木脂素經(jīng)藥理研究表明，有鎮(zhèn)靜、催眠、抗衰老、抗氧化的作用[2]。目前對于木脂素的提取工藝研究往往只針對第一次提取的工藝進行研究，如李平等[3]考察了五味子的一次提取工藝，歐陽小光等[4]直接提取兩次，以合并后的提取液中木脂素含量為指標考察五味子的提取工藝。而分別對兩次提取工藝進行考察的研究鮮有報道，然工業(yè)生產(chǎn)多為二次提取，第二次提取所用的乙醇濃度、溶劑用量、提取時間的多少亦會影響整個工業(yè)生產(chǎn)周期的成本，故為了更好地服務(wù)于工業(yè)生產(chǎn)，降低工業(yè)生產(chǎn)成本，本研究以木脂素為含量測定指標，通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法研究木脂素二次提取工藝，以期改善回流提取工藝，給工業(yè)生產(chǎn)提供可靠有效的數(shù)據(jù)參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1儀器、試劑與試藥

1.1儀器與試劑

UNICO2350型紫外-可見分光光度計（上海尤尼克有限公司）；FA1004萬分之一電子天平（上海恒平）；AUW220D十萬分之一電子天平（日本島津）；KQ-50B超聲清洗器（昆山舒美）；Design Expert 10.0統(tǒng)計軟件；所用水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2試藥

五味子醇甲（江蘇永健生物科技有限公司，161011-160725）；五味子（北京同仁堂，20170821），經(jīng)廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學院中藥教研室鑒定符合《中國藥典》（2015年版）五味子項下規(guī)定，為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥果實。

2方法與結(jié)果

2.1含量測定

2.1.1對照品溶液的制備 取34.2 mg的五味子醇甲對照品，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋成每毫升含五味子醇甲0.342 mg的溶液，精密量取5 ml，置20 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為0.0855 mg/ml的對照品溶液。

2.1.2提取濃縮液的制備 稱取五味子藥材5.0 g，加80%乙醇進行加熱回流提取，提取時間為60 min濾過，濾液回收乙醇并定容至20 ml，即得提取濃縮液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密量取“2.1.2項”下所得提取濃縮液5 ml，置100 ml具塞錐形瓶中，加甲醇25 ml，精密稱定，于超聲清洗器中提取30 min，取出，精密稱定，加甲醇補足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液1 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得供試品溶液。

2.1.4標準曲線的繪制 取0.342 mg/ml的對照品溶液1、2、5、10、15 ml，分別置于20 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，在波長278 nm處對吸光度（A）予以測定，以吸光度作為縱坐標，木脂素濃度（C）則作為橫坐標，將標準曲線繪制出，得到回歸方程：A=7.0322C-0.0004，r=0.9991（圖1）。本研究結(jié)果提示，木脂素含量為0.0171～0.256 mg/ml，與吸光度之間的線性關(guān)系良好。

圖1 五味子中木脂素的標準曲線圖

2.1.5精密度試驗 精密量取“2.1.2項”下所得同一提取濃縮液，按“2.1.3項”下方法制備，于278 nm波長處連續(xù)測定吸光度值6次，所得A值分別為0.583、0.584、0.582、0.583、0.583、0.582，RSD=0.13%，提示儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗 精密量取“2.1.2項”下所得同一提取濃縮液，按“2.1.3項”下方法制備，于278 nm波長處分別測定0、2、4、8、16、24 h時供試品的吸光度，計算含量，所得結(jié)果為1.860、1.857、1.843、1.830、1.821、1.805 mg/g，RSD=1.2%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7重復性試驗 精密量取“2.1.2項”下所得同一提取濃縮液，按“2.1.3項”下方法制備6份供試品溶液，于278 nm波長處測定吸光度，同時對含量進行計算，所得結(jié)果為1.80、1.82、1.83、1.83、1.81、1.84 mg/g，RSD=1.0%，提示該方法具有良好的重復性。

2.1.8加樣回收試驗 精密量取2.5 ml已知提取率的提取液6份，分別加入已稀釋至等量濃度的對照品溶液2.5 ml，按“2.1.3項”下方法制備供試品溶液，于278 nm波長處測定吸光度，計算平均回收率為100.5%，RSD=1.6%（表1）。

2.2單因素考察試驗

稱取五味子藥材5.0 g，采用加熱回流提取的方法，在回流提取溫度為90℃的條件下，分別從乙醇濃度、提取用時、溶劑倍量三個方面進行單因素考察。

2.2.1乙醇濃度的考察 規(guī)定提取時間為60 min，乙醇倍量為10倍，分別考察乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%時木脂素的提取率，結(jié)果提示，當乙醇濃度為70%時，木脂素提取率最高，故選擇70%作為中間水平。

2.2.2提取用時的考察 規(guī)定乙醇倍量為10倍，提取濃度為60%，分別考察提取時間為10、20、40、60、80、100 min時木脂素的提取率，結(jié)果提示，當提取時間為40 min時，木脂素提取率最大，故選擇40 min作為中間水平。

2.2.3溶劑倍量的考察 規(guī)定提取時間為60 min，提取濃度為60%，分別考察溶劑倍量為6、8、10、12、14倍時木脂素的提取率，本研究結(jié)果提示，當溶劑倍量為10倍時，木脂素提取率最高，故選擇10倍量作為中間水平。

2.3星點設(shè)計試驗

2.3.1第一次提取試驗 依照單因素考察的結(jié)果，選取乙醇進行回流提取。將連續(xù)變量乙醇濃度（X1）、溶劑倍量（X2）以及提取用時（X3）作為考察因素進行三因素-五水平的星點設(shè)計（表2）。分別稱取五味子5.0 g，按表2進行星點設(shè)計試驗，加熱回流提取的提取液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮定容成20 ml，精密量取5 ml，按“2.1.3項”下方法制備供試品溶液，測定吸光度并計算含量（mg/g）（表3）。

2.3.2模型擬合 采用Design Expert 10.0，以木脂素含量（mg/g）作為因變量對各因素進行多元線性回歸分析，經(jīng)二項式擬合，獲得擬合模型。其中多元線性回歸方程為：Y=1.529-0.006X1+0.050X2+0.042X3，r=0.372，F(xiàn)（3，11）=0.857，P=0.0483，線性模型擬合度不好，采用二項式擬合，結(jié)果為：Y=-63.12+1.49X1+1.97X2+0.25X3+0.002436X1X2+0.00009998X1X3-0.013X2X3-0.011X12-0.079X22-0.001119X32。復相系數(shù)r=0.8900，F(xiàn)=6.07，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.0001），對比線性擬合，明顯提高了擬合度，提示方程具有較高的可信度。

2.3.3第一次提取工藝參數(shù)的預測及優(yōu)化 將因變量和另外兩個因素擬合成三維曲面圖，由于僅能將兩個因素變量函數(shù)表達出，因此固定三個變量中其中一個作為中值，接著將擬合目標函數(shù)作為數(shù)學模型，并繪制因變量曲面圖（圖2、3、4）。

研究結(jié)果提示，在適宜的提取時間下，乙醇濃度60%～70%、溶劑倍量9～11倍時能獲得較理想的提取效果。在溶劑倍量適宜時，乙醇提取濃度60%～70%、提取用時23～40 min時可獲得較佳的提取效果。乙醇提取濃度保持在一定狀態(tài)時，溶劑倍量8～10倍、提取用時23～40 min時能得到較理想的提取效果。由于模型中實際所得數(shù)據(jù)比預測值要大，故以實際所得值為第一次提取的最佳工藝：X1為70%，X2為10倍，X3為70 min。

2.3.4第二次提取試驗 由于第二次提取選用的考察因素與考察指標與第一次提取一致，且為了便于將2次提取合并液的星點設(shè)計所得含量進行比較，故不再進行單因素試驗，仍選擇以第一次提取的因素設(shè)計水平一致。以連續(xù)變量乙醇濃度（X1）、溶劑倍量（X2）、提取用時（X3）為考察因素進行三因素-五水平的星點設(shè)計（表5）。分別稱取五味子藥材5.0 g，先按第一次提取的最佳工藝加熱回流提取20份，濾過，取濾渣按表5的星點設(shè)計試驗進行加熱回流提取，得提取液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至20 ml，按“2.1.3項”下方法制備供試品溶液，測定吸光度并計算含量（mg/g）（表6）。

2.3.5模型擬合 采用Design Expert 10.0專業(yè)統(tǒng)計分析軟件，以木脂素含量為因變量對各因素進行多元線性回歸，經(jīng)二項式擬合，獲取擬合模型。多元線性回歸如下：Y=0.830+0.006X1+0.037X2+0.019X3，r=0.414，F(xiàn)（3，11）=1.104，P=0.377，線性模型擬合度不好，采用二項式擬合，結(jié)果為Y=-21.21+0.41X1+1.19X2+0.14X3+0.0003499X1X2-0.014X1X3-0.003059X2X3-0.032X12-0.079X22-0.00003783X32。復相系數(shù)r=0.8445，F(xiàn)=2.76，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與線性擬合比較，擬合度有一定程度的提高，提示方程可信度高。

2.3.6第二次提取工藝參數(shù)的優(yōu)化預測 因變量與另外兩個因素擬合成三維曲面圖，由于僅能表達含兩個因素變量的函數(shù)，所以將三變量中的一個固定為中值，其后再將擬合目標函數(shù)作為數(shù)學模型，最后繪制因變量曲面圖（圖5～7）。待消耗一定提取時間后，研究結(jié)果提示，乙醇、溶劑倍量為8～10倍、濃度60～70%時提取效果比較理想。在保持一定溶劑倍量時，乙醇提取時間40～60 min，濃度范圍為60～70%時，提取效果較佳。在維持一定乙醇提取濃度時，提取時間40～60 min，溶劑倍量8～10倍時，提取效果較佳。基于2次提取時的成本問題，故認為第二次提取的最佳工藝：X1為70%，X2為10倍，X3為40 min。

2.3.7驗證試驗 分別取3份五味子藥材5.0 g，精密稱定，第一次提取加入10倍量的70%乙醇加熱回流提取70 min，濾過，取濾渣加入10倍量70%乙醇回流提取40 min，濾過，合并濾液，回收乙醇至25 ml，按“2.1.2項”下方法制備供試品溶液，測定吸光度并計算含量（mg/g），得木脂素含量分別為8.832、9.009、9.017 mg/g，平均為8.953 mg/g，RSD=1.2%，與真實工藝所得值進行比較，所得木脂素含量為9.034、9.175、9.192 mg/g，平均為9.136 mg/g，RSD=0.95%，真實值與預測值偏差為2.0%，提示建立的數(shù)學模型有良好的預測性，此項工藝條件可行高，穩(wěn)定性佳。

3討論

研究提示，五味子所含木脂素類成分可以有效地縮短潛睡期，改善人體睡眠并能有效抑制腫瘤細胞[5-9]。對于木脂素類成分的提取方法有水提取、乙醚提取和超聲提取等，因木脂素類成分在乙醇中溶解度要大于在水中的溶解度，且乙醇本身毒性小，加之超聲提取在工業(yè)大生產(chǎn)中限制較多，故本研究采用乙醇加熱回流提取。而對于這些方法的考察多采用正交設(shè)計或者均勻設(shè)計，由于正交設(shè)計對各因素之間相互作用的考慮不足，近些年，國內(nèi)學者將星點設(shè)計-響應(yīng)面法廣泛應(yīng)用于中藥制劑的制備工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制中[10-18]，相比均勻設(shè)計法與正交設(shè)計法，星點設(shè)計法獲得的結(jié)果更具有直觀性，有助于分析，還可使精確度得到提高[19]。李平等[3]運用了星點設(shè)計-響應(yīng)面法考察了乙醇濃度、溶劑倍量、提取用時對木脂素提取率的影響，但只考察了1次提取率，魏殿文等[20]采用響應(yīng)面法對五味子的超聲提取工藝進行研究，認為其最佳提取工藝為乙醇濃度95%、液固比16∶1、超聲時間25.5 min，五味子木脂素濃度5.16%。料液比和乙醇濃度較大增加了生產(chǎn)成本，本研究采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法分別對兩次提取進行了工藝考察，并通過比較預測值和真實值，獲得最佳工藝模型，后期參照《中國藥典》（2015年版）五味子含量測定項下內(nèi)容對提取液中五味子醇甲含量進行測定，其含量>0.4%，符合藥典的規(guī)定，提示該試驗?zāi)軌驖M足生產(chǎn)的要求，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考數(shù)據(jù)。

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（收稿日期：2018-04-25 本文編輯：孟慶卿）