酶放大免疫分析法與二維液相色譜法監(jiān)測(cè)癲癇患者血清中卡馬西平濃度的比較

柳航 王敏 金路 張晉萍

[摘要] 目的 比較酶放大免疫分析法（EMIT）與二維液相色譜法（2D-HPLC）測(cè)定卡馬西平血藥濃度的差異。 方法 采集67例癲癇患者卡馬西平血清樣本，分別采用EMIT法和2D-HPLC法測(cè)定，其中二維液相的色譜條件如下：第一維色譜柱為ASTON-FAQ C8柱（4.0 mm×100.0 mm，3 μm，ANAX），流動(dòng)相為乙腈-水（55∶45，v/v），流速為1 mL/min；中間柱為ASTON C18（4.6 mm×10.0 mm，3 μm，ANAX）；第二維色譜柱為Diamonsil-C18柱（4.6 mm×200.0 mm，5 μm，Dikma），流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L乙酸銨（20∶80，v/v，pH=7.0），流速為1.2 mL/min。柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。結(jié)果 兩種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且相關(guān)性好，回歸方程為y（2D-HPLC）=0.9876×x（EMIT）-0.0313，Bland-Altman分析顯示兩種方法一致性良好。 結(jié)論 EMIT法與2D-HPLC法測(cè)定的結(jié)果具有良好的一致性和相關(guān)性，應(yīng)綜合考慮實(shí)驗(yàn)室條件和人員配置等方面，采用合適的測(cè)定方法。

[關(guān)鍵詞] 卡馬西平；血藥濃度；酶放大免疫分析法；二維液相色譜法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）07（c）-0106-04

Comparison of EMIT and 2D-HPLC in the quantification of Carbamazepine in serum of patients with epilepsy

LIU Hang WANG Min JIN Lu ZHANG Jinping

Department of Pharmacy， the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School， Jiangsu Province， Nanjing 210008， China

[Abstract] Objective To compare the results of Carbamazepine in serum of patients with epilepsy determined by enzyme-multiplied immunoassay technique （EMIT） and two-dimensional liquid phase chromatography（2D-HPLC）. Methods The serum concentration of Carbamazepine in 67 epilepsy patients was determined by EMIT and 2D-HPLC， respectively. In 2D-HPLC method， two reversed phase liquid chromatography columns [ASTON-FAQ C8 （4.0 mm×100.0 mm， 3 μm， ANAX） and Diamonsil-C18 （4.6 mm×200.0 mm， 5 μm， Dikma） column] were used as the first and second separation dimensions， respectively. ASTON C18 （4.6 mm×10.0 mm， 3 μm， ANAX） column was used as a connector to transfer the eluent from the first dimensional column to the second column for further separation. The mobile phases of the two dimensions consisted of acetonitrile-H2O （55∶45， v/v） and acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate （20∶80， v/v， pH=7.0）， respectively. The first dimensional column flow rate was 1.0 mL/min， the second dimensional column flow rate was 1.2 mL/min. The detection wavelength was 285 nm， and the column temperature was 40℃. Results There were no significant differences in the serum concentrations of Carbamazepine detected by EMIT and 2D-HPLC. A good correlation was obtained between the two methods. The regression equation was y（2D-HPLC）= 0.9876 × x（EMIT）-0.0313. Bland-Altman plots analysis showed the two methods were consistent. Conclusion Both EMIT and 2D-HPLC methods have good consistency and correlation in the quantification of Carbamazepine. The laboratory conditions and staffing should be taken into consideration when a method is chosen for monitoring the concentration of Carbamazepine.

[Key words] Carbamazepine； Serum drug concentration； Enzyme-multiplied immunoassay technique； Two-dimensional liquid phase chromatography

癲癇（epilepsy）是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病?？R西平（Carbamazepine）屬于氨基二苯乙烯衍生物，是治療各種類(lèi)型癲癇發(fā)作的首選藥物，也是治療三叉神經(jīng)痛和舌咽神經(jīng)痛發(fā)作以及躁狂抑郁癥的一線藥物[1-3]。由于其治療窗窄（4～12 μg/mL），個(gè)體差異大，常見(jiàn)的不良反應(yīng)包括視力模糊、頭暈、乏力、惡心、嘔吐等，在臨床應(yīng)用中，需要對(duì)患者的卡馬西平血清藥物濃度進(jìn)行檢測(cè)。依據(jù)檢測(cè)的結(jié)果，調(diào)整和優(yōu)化卡馬西平給藥劑量，提高療效的同時(shí)避免和降低患者毒副作用[4-6]。目前國(guó)內(nèi)各家醫(yī)院，卡馬西平血清藥物濃度測(cè)定的主要方法包括紫外分光光度法[7]、高效液相色譜法[8]、免疫檢測(cè)法[9]、液質(zhì)聯(lián)用法[10]等。綜合考慮本科室的儀器條件和人員配置，作者分別采用酶放大免疫分析法（EMIT）和二維液相色譜法（2D-HPLC）檢測(cè)卡馬西平血清藥物濃度，通過(guò)比較分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，考察兩種測(cè)定方法的準(zhǔn)確度與相關(guān)性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

全自動(dòng)臨床化學(xué)分析儀VIVA-E（德國(guó)西門(mén)子公司）；2D-HPLC系統(tǒng)[全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀FLC2701（湖南德米特儀器有限公司）與LC-20A色譜部件（日本島津公司）構(gòu)成]；80-2低速離心機(jī)（常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；centrifuge5424高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；Vortex2渦旋儀（德國(guó)艾卡公司）；BS224型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試劑

卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：100142-201105，純度：99.7%）；Emit2000卡馬西平檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：4F018UL-J2，①抗體/底物試劑：抗卡馬西平鼠單克隆抗體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖-6-磷酸鹽、防腐劑、疊氮化鈉和穩(wěn)定劑；②酶試劑：用細(xì)菌的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶標(biāo)記的卡馬西平、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、防腐劑、疊氮化鈉和穩(wěn)定劑，購(gòu)自德國(guó)Dade Behring inc公司）；BIO-RAD血清復(fù)合質(zhì)控品[批號(hào)：57351、57352、57353，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；乙腈（色譜純，美國(guó)天地公司）；乙酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；去離子水由密理博純水機(jī)制備。

1.3 樣本

收集2017年4月15日～2017年10月31日南京鼓樓醫(yī)院門(mén)診和住院部服用卡馬西平的患者血清樣品，總共67份，同一份血清樣品分成2份，兩種方法分別檢測(cè)。

2 方法與結(jié)果

2.1 EMIT法樣品的處理與檢測(cè)

取濃度為0、2、4、8、12、20 μg/mL的卡馬西平定標(biāo)溶液，采用卡馬西平試劑盒檢測(cè)，上機(jī)后儀器自動(dòng)進(jìn)樣，依據(jù)定標(biāo)點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于后續(xù)樣品測(cè)定。

2.2 2D-HPLC法的樣品處理與檢測(cè)

2.2.1 色譜條件 第一維色譜柱為ASTON-FAQ C8柱（4.0 mm×100.0 mm，3 μm，ANAX），流動(dòng)相為乙腈-水（55∶45，v/v），流速為1 mL/min；中間柱為ASTON C18（4.6 mm×10.0 mm，3 μm，ANAX）；第二維色譜柱為Diamonsil-C18柱（4.6 mm×200.0 mm，5 μm，Dikma），流動(dòng)相為乙腈-20 mmol/L乙酸銨（20∶80，v/v，pH=7.0），流速為1.2 mL/min。柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm。

2.2.2 樣品預(yù)處理 取血清樣品300 μL于1.5 mL離心管中，加入600 μL乙腈，振蕩混勻30 s，14 000 r/min離心5 min，離心半徑為9.24 cm，取上清液400 μL，進(jìn)樣2D-HPLC系統(tǒng)檢測(cè)分析。

2.2.3 方法專(zhuān)屬性試驗(yàn) 在本研究所采用的色譜條件下，卡馬西平的保留時(shí)間在6.79 min左右，峰形良好，拖尾因子在0.97～1.02之間，血清中的內(nèi)源物質(zhì)和其他雜質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定沒(méi)有影響，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用空白牛血清配制濃度分別為0.43、1.08、2.71、6.77、16.92、42.30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血清樣品，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)曲線6個(gè)點(diǎn)，同時(shí)制備空白血清樣品。按“2.2.2”項(xiàng)下預(yù)處理血清樣品，采用2D-HPLC檢測(cè)。以6個(gè)不同濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積As為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到卡馬西平線性回歸方程：As=201609C+15806（r2 = 0.9994）。

2.3 EMIT法與2D-HPLC法準(zhǔn)確度和精密度比較

EMIT法測(cè)定商品化的卡馬西平血清質(zhì)控，含低、中、高3種濃度（3.12、8.70、15.30 μg/mL）的樣品各5份，連續(xù)測(cè)定3 d；平行制備含低、中、高3種濃度（1.36、21.15、33.84 μg/mL）的卡馬西平含藥血清各5份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理，采用2D-HPLC進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各血清樣品中卡馬西平的濃度，連續(xù)測(cè)定3 d。分別考察兩種方法的日內(nèi)、日間精密度及準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可見(jiàn)，EMIT和2D-HPLC兩種方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合生物樣品檢定要求[11-12]。

2.4 檢測(cè)結(jié)果分析

EMIT法的最低定量限為2 μg/mL，67個(gè)樣品中有5個(gè)樣品未能達(dá)到EMIT法的最低定量限，無(wú)法得出準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，其余62個(gè)樣品EMIT檢測(cè)結(jié)果的平均值為（6.24±2.50）μg/mL；67個(gè)待測(cè)樣品均達(dá)到2D-HPLC方法的最低定量限，檢測(cè)結(jié)果的平均值為（5.77±2.78）μg/mL。剔除未達(dá)EMIT法最低定量限的5個(gè)樣品，62個(gè)樣品經(jīng)兩種方法測(cè)定血清中的卡馬西平濃度比較分析（圖2），經(jīng)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩種方法檢驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.81）。

采用Bland-Altman分析和Pearson相關(guān)分析，考察62個(gè)樣品兩種方法分別檢測(cè)所得結(jié)果的相關(guān)性?；贐land-Altman分析，繪制圖3，可見(jiàn)兩種方法測(cè)定結(jié)果比值的平均值為1.03，95%一致性界限分別為1.33和0.79，96.77%（60/62）的點(diǎn)在95%一致性界限內(nèi)，說(shuō)明兩種方法一致性良好。以EMIT法測(cè)得的濃度為x，以2D-HPLC法測(cè)得濃度為y，得回歸方程為y（2D-HPLC）=0.9876×x（EMIT）-0.0313，Pearson分析顯示兩者相關(guān)性良好（r = 0.9597，P < 0.01），見(jiàn)圖4。

3 討論

3.1 方法原理比較

EMIT檢測(cè)的原理是樣品中的卡馬西平與試劑中用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH）酶標(biāo)的卡馬西平競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，與抗體結(jié)合后，酶活性降低，試劑中的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸被有活性的G6PDH轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，造成吸光度改變，應(yīng)用分光光度計(jì)間接測(cè)定卡馬西平的血藥濃度[13]。

2D-HPLC是在常規(guī)HPLC的基礎(chǔ)上，增加一維色譜柱，總共3個(gè)步驟完成血清中卡馬西平的檢測(cè)。首先，樣品通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，在一維色譜柱ASTON-FAQ C8（4.0 mm×100 mm，3 μm，ANAX）上初步分離，然后，樣品中的卡馬西平被中間柱ASTON C18（4.6 mm ×10 mm，3 μm，ANAX）截取保留，最后，轉(zhuǎn)移至二維柱Diamonsil-C18（4.6 mm×200 mm，5 μm，Dikma）上，進(jìn)行分離，由紫外檢測(cè)器完成檢測(cè)。色譜工作站通過(guò)時(shí)間程序控制3個(gè)步驟的切換，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制，大大減少生物樣品中內(nèi)源性物質(zhì)及其他共存成分的干擾[14-15]。

3.2 線性范圍比較

EMIT最低定量限為2 μg/mL，線性范圍為0～20 μg/mL。2D-HPLC最低定量限為0.43 μg/mL，線性范圍為0.43～42.30 μg/mL。

3.3 檢測(cè)過(guò)程和結(jié)果比較

從檢測(cè)過(guò)程來(lái)看，EMIT采用商品化的試劑盒檢測(cè)，具有樣本檢測(cè)時(shí)間短、用量少、前處理簡(jiǎn)單、多個(gè)品種能夠同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，適用于急診和大批量樣本的分析測(cè)定，其缺點(diǎn)在于儀器和試劑盒依賴(lài)進(jìn)口，價(jià)格昂貴[16-18]；而2D-HPLC檢測(cè)靈敏度高，試劑成本低，但不同品種樣品需要更換色譜柱和流動(dòng)相，預(yù)處理復(fù)雜，在方法的建立以及儀器的使用和維護(hù)方面對(duì)操作人員要求更高。

從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，采用Bland-Altman分析和Pearson相關(guān)分析，兩組測(cè)定結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有良好的一致性和相關(guān)性。

綜上所述，EMIT和2D-HPLC均為有效且可靠的卡馬西平血清濃度監(jiān)測(cè)方法，應(yīng)綜合考慮實(shí)驗(yàn)室條件和人員配置等方面，選擇合適的測(cè)定方法。

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（收稿日期：2018-03-02 本文編輯：張瑜杰）